田宏現(xiàn) ，苑 平 ，王曼玲 ，劉 藝 ，李 菁 ，夏新界 ，譚曉風(fēng)

獼猴桃ACC氧化酶反義基因轉(zhuǎn)化獼猴桃的研究

田宏現(xiàn)1，2，苑 平2，王曼玲3，劉 藝2，李 菁2，夏新界3，譚曉風(fēng)1

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長沙 410004；2.吉首大學(xué)，湖南 吉首 416000；3.中國科學(xué)院 亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 , 湖南 長沙 410125）

為建立獼猴桃ACC氧化酶反義基因功能研究技術(shù)平臺并通過生物技術(shù)改良獼猴桃，從海沃德獼猴桃（Actinidia chinensis Planch.var.deliciosa‘Hayward’）葉片中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，并以此為模板，擴(kuò)增得到ACC氧化酶（ACO）基因片段約1 kb，經(jīng)限制性內(nèi)切酶圖譜分析，組建亞克隆并進(jìn)行測序，其開放閱讀框長957 bp，編碼319個氨基酸，與其他已公布的ACC氧化酶cDNA的核苷酸（AB003514.1）及氨基酸序列（BAA21541.1）同源率分別高達(dá)94.0 %和95.6 %，證明所克隆的cDNA序列的準(zhǔn)確性。構(gòu)建該基因的反義表達(dá)載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法成功轉(zhuǎn)化米良一號獼猴桃（Actinidia deliciosa cv.Miliang-1），得到再生苗。取14株經(jīng)PCR檢測，其中10株檢測到ACC氧化酶基因目的條帶，陽性植株占71.4 %。實時熒光定量PCR分析結(jié)果顯示，再生苗ACO基因的表達(dá)量低于野生型58%～81%。

獼猴桃； ACC氧化酶；農(nóng)桿菌介導(dǎo)；反義表達(dá)載體

米良1號是吉首大學(xué)在上世紀(jì)80年代選育出的美味獼猴桃優(yōu)良品種，它樹勢強(qiáng)健，適應(yīng)性強(qiáng)，抗旱抗病蟲，果大豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，深受果農(nóng)歡迎；其肉質(zhì)細(xì)嫩、風(fēng)味純正、酸甜適度、清香宜人，加上維生素c、總糖、可溶性固形物含量均高于海沃德獼猴桃，頗受消費(fèi)者青睞[1]。但采后常溫下貯運(yùn)月余開始軟腐，失去其應(yīng)有的經(jīng)濟(jì)價值，在貯運(yùn)和鮮銷上有很大的困難，急需對其進(jìn)行遺傳改良。獼猴桃的品種很多，有數(shù)十種，但都有貯存性能急需進(jìn)行遺傳改良的問題。例如新品種紅陽A .chinensis Planch. var. chinensis，相對其他品種來說,口感最好,但貯藏矛盾就更突出。研究表明，獼猴桃果實屬呼吸躍變型果實，呼吸躍變高峰與乙烯的產(chǎn)生相關(guān)[2-4]，器官中乙烯合成量的增加將引起果實呼吸強(qiáng)度增加，導(dǎo)致果實中多聚半乳糖酸酶、淀粉酶、過氧化物酶、脂氧合酶、多酚氧化酶等代謝酶的活性升高，使細(xì)胞膜透性升高、細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞、果實硬度下降，加速果實軟化，貯藏時間變短。乙烯在植物體內(nèi)的合成是從甲硫氨酸開始的，甲硫氨酸在S-腺苷轉(zhuǎn)移酶作用下轉(zhuǎn)變成S-腺苷甲硫氨酸，然后S-腺苷甲硫氨酸由1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合成酶（ACC合成酶）催化形成1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid, ACC），最后，ACC在ACC氧化酶（ACC oxidase, ACO)催化下形成乙烯[5]。乙烯在植物體內(nèi)的生物合成主要是由ACC合成酶和ACC氧化酶這兩個限速酶來控制的，通過調(diào)節(jié)它們的表達(dá)能有效地調(diào)節(jié)乙烯的合成量[6]。ACC氧化酶催化ACC轉(zhuǎn)化為乙烯，是乙烯生物合成途徑中的最后一個酶，其活性高低直接決定植物體內(nèi)乙烯生成量的多少[7]。目前，番茄、卡特蘭、酸橙、富有柿果、香蕉、梨、蘋果等中的ACC氧化酶基因均已經(jīng)被克隆并測序[8]。由于核糖體不能翻譯雙鏈的RNA，所以ACC氧化酶的mRNA與和該mRNA有特異性堿基互補(bǔ)關(guān)系的反義RNA結(jié)合為雙鏈后，即抑制了該mRNA的翻譯。根據(jù)ACC氧化酶基因序列，人工合成反義RNA基因，并將其導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄成反義RNA，即能抑制ACC氧化酶基因的表達(dá)，減少或阻斷果實中乙烯的合成，大大延長呼吸躍變型果實采收后的貯藏保鮮時間。1990年，Hamilton等[9]將ACO基因的反義基因?qū)敕押?，實現(xiàn)了對番茄果實乙烯生成和成熟的控制。Picton等[10]將ACO基因的反義RNA導(dǎo)入番茄后，轉(zhuǎn)基因番茄果實的乙烯含量比對照組下降了90%，成熟時間達(dá)到了3個星期才能變紅，而對照組只有7 d。獼猴桃有人做過ACC氧化酶基因克隆和測序[11-12]，但構(gòu)建獼猴桃ACO基因的反義表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化獼猴桃，并獲得陽性再生苗的研究還未見報道。本文成功地構(gòu)建了獼猴桃ACO基因的反義表達(dá)載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，轉(zhuǎn)化米良一號獼猴桃，經(jīng)過PCR檢測和實時熒光定量PCR分析證實獲得了轉(zhuǎn)基因植株。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 海沃德獼猴桃幼苗和米良一號獼猴桃枝條

海沃德獼猴桃A. chinensis Planch.var.deliciosa‘Hayward’幼苗由吉首大學(xué)石澤亮教授惠贈的海沃德獼猴桃果實收集種子，經(jīng)低溫砂藏后種植而得。受體植物米良一號獼猴桃（A.deliciosa cv.Miliang-1 Shi Ze-liang）枝條由石澤亮教授贈送。

1.1.2 試劑

膠回收試劑盒選購于AxyGen公司，cDNA合成試劑盒、TA克隆試劑盒、LA Tap酶、Trizol等購于Takara公司，其它試劑為國藥集團(tuán)產(chǎn)品。

1.1.3 菌種和質(zhì)粒

根癌農(nóng)桿菌菌株為EHA105，質(zhì)粒為pCAMBIA1300-163，由中科院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所提供。該質(zhì)粒T-DNA區(qū)結(jié)構(gòu)如圖1，其中含有潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hpt)。

圖1 植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-163的T-DNA區(qū)Fig.1 Schematic T-DNA zone of plant representative plasmid pCAMBIA1300-163

1.1.4 培養(yǎng)基

誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS + 10 mg·L-16-BA + 0.2 mg·L-1NAA + 0.2 mg·L-1TDZ + 30 g·L-1蔗糖 + 7.5 g·L-1瓊脂，pH 6.0；

繼代培養(yǎng)基：MS + 0.25 mg·L-16-BA + 1 mg·L-1NAA + 30 g·L-1蔗糖 + 7.5 g·L-1瓊脂，pH 6.0；

共培養(yǎng)基：MS + 0.25 mg·L-16-BA + 1 mg·L-1NAA + 30 g·L-1蔗糖 + 0.1 mmol·L-1乙酰丁香酮 +7.5 g·L-1瓊脂，pH 5.6；

篩選培養(yǎng)基：MS + 0.25 mg·L-16-BA + 1 mg·L-1NAA + 500 mg·L-1頭胞霉素 + 400 mg·L-1羧芐青霉素 + 20 mg·L-1潮霉素 + 30 g·L-1蔗糖 + 7.5 g·L-1瓊脂，pH 6.0；

預(yù)分化培養(yǎng)基：MS + 3.0 mg·L-1ZT + 0.5 mg·L-16-BA + 0.05 mg·L-1NAA + 30 g·L-1蔗糖 + 400 mg·L-1羧芐青霉素 + 7.5 g·L-1瓊脂，pH 6.0；

分化培養(yǎng)基：MS + 1.0 mg·L-1ZT + 30 g·L-1蔗糖+ 400 mg·L-1羧芐青霉素 + 7.5 g·L-1瓊脂，pH 6.0；

生根培養(yǎng)基：1/2 MS + 0.7 mg·L-1IBA + 0.15 mg·L-16-BA + 15 g·L-1蔗糖 + 7.5 g·L-1瓊脂，pH 6.0。

1.2 方 法

1.2.1 獼猴桃RNA的提取

RNA提取緩沖液于65℃水浴鍋中溫育30 min以上，然后在緩沖液中加入2%～5% β-ME，立即取新鮮嫩葉加緩沖液于研缽中快速研磨（0.1 g新鮮嫩葉/ 1 mL緩沖液）。把研磨好的，成粘稠狀的勻漿液移入離心管中，65℃溫育10 min，加入等體積氯仿∶異戊醇（24∶1），上下劇烈震蕩15 s，然后于4℃，12 000 g，離心10 min。取上清，重復(fù)上述抽提步驟2～3次。取上清，加入1/4體積的10 mol LiCl溶液并混勻，-20 ℃條件下放置12 h以上，使RNA沉淀。4℃，12 000 g，離心20 min，棄上清，獲粗提的總RNA沉淀。加入DEPC處理過的H2O重新溶解RNA。再加入1/10體積的3 mol NaAc，2.5體積的96 %乙醇。置于-20℃，1 h，使RNA沉淀。4℃，12 000 g，離心20 min，棄上清，用75 %乙醇清洗沉淀，空氣中干燥后加入DEPC處理過的H2O溶解，保存于-70℃?zhèn)溆茫ㄒ部芍苯佑脽o水乙醇保存）。

1.2.2 cDNA第一鏈的合成

取1 μg mRNA作模板，于20 μL反應(yīng)體系中加入 7 μL(約 1 μg)mRNA、1 μL Oligo(dT)18 primer、4 μL DEPC-treated Water，65℃水浴 5 min，冰上放置 3～ 4 min。接著加入 4 μL 5×reaction buffer、1 μL RiboLock ? RNase Inhibitor (20 u/μL)、2 μL 10 mmol dNTP mix、1 μL RevertAid ? M-MuLVReverse Transcriptase (200 U/μL)，42℃水浴 60 min，70℃水浴5 min終止反應(yīng)。cDNA可在-20℃暫時保存不超過一個星期，-70℃長期保存。

1.2.3 PCR擴(kuò)增

引物設(shè)計參照海沃德的基因序列，使用Primer Expression 5.0軟件設(shè)計PCR引物，由invitrogen公司合成。上游引物，5′-CCCGGGAGAGAGAT GGAGGCTTTCCCA-3′； 下 游 引 物，5′-GTCGAC TCACACAAACACAAGCGGCG-3′。 以 cDNA 為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃30 s，56℃ 45 s，72℃ 1.2 min，35 cycles；72℃ 10 min；22℃保溫10 min。PCR反應(yīng)使用LATaq酶。

1.2.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆與序列分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析后，回收特異片段，連接到載體pMD18-T Vector當(dāng)中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞。在選擇培養(yǎng)基上挑取單菌落搖菌，用堿法少量提取質(zhì)粒并做酶切鑒定。將陽性克隆送華大基因測序。

1.2.5 ACC氧化酶反義表達(dá)載體的構(gòu)建

從海沃德獼猴桃中克隆得到ACC氧化酶基因的cDNA片段，測序確定為所需片段后將其反向連入表達(dá)載體pCAMBIA1300 -163當(dāng)中，得到獼猴桃ACC氧化酶基因的反義表達(dá)載體。

1.2.6 遺傳轉(zhuǎn)化

組織培養(yǎng)：米良一號獼猴桃愈傷組織和無菌苗的培養(yǎng)，參考田宏現(xiàn)等的方法[1]。

農(nóng)桿菌與愈傷組織的共培養(yǎng)：取EHA105(含pCAMBIA1300-163 質(zhì)粒 )劃 LB 板 (加 Kan 50 mg·L-1和CHL 34 mg·L-1)，28℃培養(yǎng)2 d后挑單菌落，在LB板劃線，28℃過夜培養(yǎng)，用液體共培養(yǎng)基將菌洗下，調(diào)OD600=0.6；挑選表面干爽、結(jié)構(gòu)致密的愈傷組織浸入上述菌液中，每隔5 min搖一次，浸泡30 min后用滅菌濾紙吸干愈傷組織表面多余菌液，將愈傷轉(zhuǎn)移到固體共培養(yǎng)基上，25～26℃下暗培養(yǎng)3～4 d。

抗性愈傷組織的篩選：將共培養(yǎng)3 d后的愈傷移入滅菌三角瓶，無菌水沖洗5次至液體不渾濁，再用含有 500 mg·L-1頭胞霉素和 400 mg·L-1羧變青霉素的無菌水浸泡30 min，其間每隔5 min搖一次。用滅菌濾紙吸干水分，轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基上，25～26℃暗培養(yǎng)20 d后，將抗性愈傷轉(zhuǎn)移到新的篩選培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。

抗性愈傷組織的分化：兩次篩選后，將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基上，置于25～26℃，光強(qiáng)1000～1500 lx，每天14 h光照培養(yǎng)，每20 d更換一次新培養(yǎng)基。當(dāng)愈傷開始變成紅褐色并開始分化出芽時將愈傷轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上。

抗性植株的生根：待苗長至3～5 cm高時，切下轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上，置光照培養(yǎng)箱中，條件同預(yù)分化。

抗性植株的煉苗：挑根多而粗壯的抗性植株，室內(nèi)擰松瓶蓋3 d后用自來水將幼苗根上的培養(yǎng)基沖洗干凈，移栽到裝有基質(zhì)（土∶珍珠巖體積比=3∶1）的盆子，置于置物箱中室內(nèi)煉苗2周后打開置物箱，室內(nèi)煉苗3 d，移至室外7d即可移入實驗田中。

1.2.7 抗性植株的PCR檢測

經(jīng)過轉(zhuǎn)化獲得29株潮霉素抗性植株，隨機(jī)選取其中14株提取基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。取抗性獼猴桃植株幼嫩葉片0.2～1.0 g，采用CTAB區(qū)室法提取基因組DNA。擴(kuò)增產(chǎn)物為575 bp的基因片段。上游引物為Term F：5′-GGTGCTTTCCCAGTCCAAATCGTT-3′。 下 游引物為 Term R：5′-CCAGGTTTAGTCGTCTCGTG TCTGGT-3′。

PCR擴(kuò)增體系(20 μL)：Takara公司TaqDNA聚合酶 (5 mmol·μL-1) 0.2 μL，10×Buffer (KCl)緩沖 液 2.0 μL，MgCl2 1.6 μL，dNTP Mixture 2.0 μL，Term F(20 mmol·μL-1) 0.4 μL，Term R(20 mmol·μL-1) 0.4 μL，模板 1 μL，ddH2O 12.4 μL。

PCR反應(yīng)程序為：95℃ 5 min；94℃ 35 s，59℃ 35 s，72℃ 45 s；35 cycles；72℃ 10 min。取PCR產(chǎn)物10 μL進(jìn)行瓊脂糖(1.0 %)凝膠電泳檢測。

1.2.8 抗性植株的實時PCR檢測

由于獼猴桃屬于木質(zhì)藤本，組培苗要3～5年才能結(jié)果，果實中靶基因表達(dá)結(jié)果的確定還有一段長時間的等待。故隨機(jī)挑選5株經(jīng)PCR鑒定為陽性的再生轉(zhuǎn)基因獼猴桃植株和一株野生型米良一號植株，剪其葉片進(jìn)行熒光定量實時PCR檢測，檢測靶基因的表達(dá)豐度。為獼猴桃ACO基因的反義基因?qū)牒螳@得的再生植株的定性提供進(jìn)一步的間接依據(jù)。提取獼猴桃總RNA[13]，用Fermentas公司的DNase處理以去除混入的基因組DNA（按說明書操作）。采用invitrogen公司的PlatinumR SYBRR Green qPCR SuperMix-UDG(C11733-038)及 CFX96?Real-Time PCR Detection System熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR產(chǎn)物實時熒光檢測。使用AlleleID 5軟件設(shè)計引物，目的基因引物為ACO-F：5′-CGAGGACACGGAGGGTAGTTG-3′，ACO-R：5′-ACTGGACCTGCTATGTGAGAACG-3′，擴(kuò)增片段長117 bp；內(nèi)參基因為Action，其特異性引物為Action-F：5′-GCATCCCTCAGCACCTTTCAAC-3′，Action-R：5′-AAGCAGTCGCATAACTCAGAAGC-3′，擴(kuò)增片段長105 bp。熱循環(huán)設(shè)置：48℃30 min；95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，40 cycles。

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃總RNA的提取

提取的獼猴桃總RNA經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見28 S、18 S兩條清晰的rRNA條帶，且兩條帶亮度比約為2∶1，表明總RNA未出現(xiàn)降解，完整性較好。紫外分光光度計測定的A 260 nm/A 280 nm比值在1.9～2.0之間，表明其純度較高，無蛋白和DNA污染(圖2)。

圖2 獼猴桃總RNA電泳圖Fig. 2 Electrophoregram of total RNA of kiwifruit

2.2 ACC氧化酶cDNA的PCR擴(kuò)增與全序列測定

用高保真的Taq酶成功的克隆得到1 kb左右的ACC氧化酶cDNA目的條帶（圖3）。

圖3 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析Fig. 3 Electrophoretic analysis of agarose gel of PCR products

測序分析顯示此cDNA全長為1003 bp。通過Vector Nti Explorer分析該基因的開放閱讀框（ORF）為957 bp，編碼一條319個氨基酸殘基的多肽，經(jīng)Blastn分析表明與設(shè)計引物時所用的國外報導(dǎo)的海沃德核苷酸序列(AB003514.1)有11個堿基不同，相似性為94 %，氨基酸序列中有2個氨基酸不同（見圖4）。從而證實克隆所得確為獼猴桃ACC氧化酶基因的cDNA，已提交到GenBank當(dāng)中，登陸號為JQ062390。

2.3 ACO基因反義表達(dá)載體的構(gòu)建

用SmaⅠ、SalⅠ做雙酶切鑒定構(gòu)建完成的反義表達(dá)載體，目的片段為1015 bp（如圖5）。由酶切結(jié)果得出，我們成功的將ACO基因反向的連入中間載體pJIT163，并成功的從pJIT163上將啟動子、目的基因和終于止一起切下，連入表達(dá)載體pCAMBJA1300。

2.4 遺傳轉(zhuǎn)化

莖段愈傷誘導(dǎo)以繼代培養(yǎng)基為好，愈傷結(jié)構(gòu)致密，顏色較深。葉片誘導(dǎo)以誘導(dǎo)培養(yǎng)基為好，接種7 d開始出愈傷，葉片愈傷誘導(dǎo)率為100%（圖6-A）。

繼代：培養(yǎng)基選用繼代培養(yǎng)基，20 d左右繼代一次。愈傷組織結(jié)構(gòu)致密，顏色翠綠，基本上不會出現(xiàn)褐化，但當(dāng)繼代時間超過30 d時，愈傷結(jié)構(gòu)開始變疏松，顏色變白，后期分化效率變低（圖6-B）。

篩選抗性愈傷：以繼代培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在其中添加20 mg·L-1潮霉素用于篩選抗性愈傷較好，愈傷的存活率為43.3%。抗性愈傷剛開始時為白色，添加頭孢霉素和羧變霉素能有效抑制農(nóng)桿菌的生長（圖6-C）。

圖4 獼猴桃 ACO cDNA 序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列Fig. 4 Sequences of ACO cDNA and its deduced protein

圖5 表達(dá)載體的Sma I和Sal I雙酶切鑒定Fig.5 Estion result of SmaI and SalI of expression vector

分化：將抗性愈傷接到ZT的濃度加大到3.0 mg·L-1的預(yù)分化培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)可加速芽的誘導(dǎo)。在預(yù)分化的過程中逐漸變成綠色，當(dāng)愈傷開始變成紅褐色時，再將愈傷接到ZT濃度降至1.0 mg·L-1分化培養(yǎng)基上，開始分化出芽（圖6-D）。

生根：抗性愈傷分化芽接到1/2 MS + 0.7 mg·L-1IBA + 0.15 mg·L-16-BA的生根培養(yǎng)基上，20 d左右誘導(dǎo)出根，根比較粗狀，平均每個芽10條根左右（圖6-E）。

煉苗：經(jīng)煉苗后將其釋放到環(huán)境中去，存活率可達(dá)到90%以上（圖6-F）。

2.5 抗性植株的PCR檢測

抗性植株ACC氧化酶基因的PCR檢測結(jié)果如圖7。結(jié)果顯示14株中有10株擴(kuò)出目的條帶，為陽性植株，陽性植株率為71%。目的條帶大小為575 bp，抗性植株中10株的擴(kuò)增片段大小與陽性對照的條帶一致，而陰性對照（水和非轉(zhuǎn)基因米良一號植株）沒有目的條帶，證明目的基因已整合到轉(zhuǎn)化米良一號的基因組中。

2.6 實時熒光定量PCR分析

所得數(shù)據(jù)按相對定量法進(jìn)行定量計算，目的基因相對表達(dá)量計算公式為Rel.Exp=2ΔΔCt，其中Ct值為閾值循環(huán)數(shù)(Threshold cycle)，ΔΔCt=(未知樣品ΔCt)－(參比樣ΔCt)，未知樣品ΔCt=(內(nèi)參基因Ct)－(目的基因Ct)，參比樣ΔCt=(參比樣內(nèi)參基因Ct)－(參比樣目的基因Ct)[14]（如圖8）。

圖6 米良一號農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系Fig.6 Genetic transformation of Miliang-1 by Agrobacterium-mediated method

圖7 轉(zhuǎn)化植株的PCR分析Fig.7 PCR analyses of transformed plants

圖8 轉(zhuǎn)化植株的real time PCR分析Fig. 8 Real time PCR analyses of transformed plants

由圖可看出將ACO基因在M1（野生型對照）植株中的相對表達(dá)量定為1，M2～M6的相對表達(dá)量比野生型要低58%～81%。

3 結(jié)論與討論

本次研究中以海沃德獼猴桃的幼苗為材料，從中提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并克隆得到獼猴桃ACO基因。測序后得出此基因全長1003 bp，開放閱讀框(ORF)為957 bp，編碼一條319個氨基酸殘基的多肽，經(jīng)Blastn分析表明與設(shè)計引物時所用的國外報導(dǎo)的海沃德核苷酸序列(AB003514.1)有11個堿基不同，相似性為94 %，氨基酸序列中有2個氨基酸不同，進(jìn)一步證實了我們所克隆得到的為獼猴桃ACO基因。并成功提交到GenBank當(dāng)中登陸號為JQ062390。

成功克隆獼猴桃的ACO基因后，擬通過反義RNA技術(shù)來抑制獼猴桃乙烯的生物合成，達(dá)到延遲獼猴桃成熟的效果，成功構(gòu)建了ACO基因的反義表達(dá)載體。并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法成功轉(zhuǎn)化獼猴桃，所得抗性植株經(jīng)PCR檢測，證明本研究得到了獼猴桃ACC氧化酶轉(zhuǎn)基因再生苗。挑選5株經(jīng)PCR鑒定為陽性的紅陽獼猴桃植株進(jìn)行實時熒光PCR檢測，結(jié)果表明ACO基因在轉(zhuǎn)基因植株中的相對表達(dá)量比野生型降低58%～81%。成功的降低了ACO基因在獼猴桃中的表達(dá)活性，進(jìn)一步驗證了該實驗結(jié)果的可靠性。ACO基因在轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)表達(dá)的差異可能與插入的拷貝數(shù)和插入位點有關(guān)。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法是一個細(xì)菌和愈傷組織共同作用的復(fù)雜過程。凡是涉及到細(xì)菌活性或愈傷組織狀態(tài)的因素都可能影響轉(zhuǎn)化效果。對米良一號而言，一方面是愈傷分化較難，另一面是潮霉素篩選時對愈傷組織造成傷害，潮霉素濃度過高時愈傷完全不能生長。篩選時培養(yǎng)基中合適的潮霉?jié)舛仁呛Y選成功的關(guān)鍵所在。目前仍未見農(nóng)桿菌介導(dǎo)ACC氧化酶反義基因轉(zhuǎn)化獼猴桃獲得再生苗的報道。通過本實驗的研究，找到合適的誘導(dǎo)、繼代、分化培養(yǎng)基并優(yōu)化了生根條件，為農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因獼猴桃提供合適的組培體系。另一方面，本實驗通過對潮霉素濃度的摸索，找到了一個適合用于米良一號篩選的潮霉素濃度，即在繼代培養(yǎng)基中添加20 mg/L的潮霉素用于抗性愈傷的篩選。并對侵染時農(nóng)桿菌的濃度，愈傷的處理以及共培養(yǎng)的條件等進(jìn)行了優(yōu)化且取得了較為理想的效果。

米良一號獼猴桃屬于多糖多酚類植物，多糖物質(zhì)主要存在于葉中，葉片越老多糖含量越高，在DNA提取過程中，這些物質(zhì)容易與DNA不可逆地粘附在一起而污染DNA，從而抑制DNA限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、TaqDNA聚合酶等多種分了生物學(xué)酶類的活性，傳統(tǒng)的CTAB法、SDS法等都很難達(dá)到要求，本實驗中我們采用CTAB區(qū)室法提取米良一號獼猴桃葉片中的基因組DNA，并對其進(jìn)行一定改進(jìn)使所得到的基因組DNA能夠滿足PCR鑒定和Southern印跡雜交要求。

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Genetic transformation of kiwifruit with its ACC oxidase antisense gene

TIAN Hong-xian1,2, YUAN Ping2, WANG Man-ling3, LIU Yi2, LI Jing2, XIA Xin-jie3, TAN Xiao-feng1
(1. Central South University of Forestry And Technology, Changsha 410004, Hunan, China; 2. Jishou University, Jishou 416000, Hunan,China; 3. Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, Hunan, China)

In order to establish the technology platform for the kiwifruit's with Its ACC oxidase antisense gene functions and improve kiwifruit quality through bio-technology, the kiwifruit leaves ( from Actinidia chinensis Planch.var.deliciosa‘Hayward’ ) were used to clone a cDNA of ACO gene, and its sequence was analysed.. The sequence was 1003 bp in length, with an open reading frame of 957 bp, encording 319 amino acid residues. The DNA sequence and its deduced amino acid sequence showed 94.0 % and 95.6 % homology and similarity with the sequences of Hayward plants in GenBank, respectively. Ten of the analyzed plants were shown to be positive for the ACO gene insert (71.4 %). The result of Quantitative Real-Time Fluorescence PCR Technology shows that the ACC oxidase gene expression of re-growth leaves was 58%～81% of the wild type.

Actinidia deliciosa (A. Chev.): ACC oxidase；agrobacterium-mediated；antisense expression vector

S759.3

A

1673-923X(2012)11-0115-07

2012-10-10

湖南省省級科技計劃(專項計劃）項目“耐貯保鮮高抗性轉(zhuǎn)基因獼猴桃的研究和開發(fā)”（編號：2008JT3008)；湖南省高校產(chǎn)學(xué)研合作示范基地開放項目（2011jsjk003）

田宏現(xiàn)（1953-），男，湖南保靖人，教授，碩士生導(dǎo)師，博士研究生，主要從事微生物學(xué)和林業(yè)生物技術(shù)方面的研究；E-mail：jstianhx@163.com；電話：13974310662

譚曉風(fēng)（1956-），男，湖南茶陵人，教授，博士生導(dǎo)師，博士，主要從事經(jīng)濟(jì)林和林業(yè)生物技術(shù)研究；E-mail：tanxiaofengcn@126.com.cn；夏新界（1959-）,男，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，主要研究方向為作物耐逆分子生物學(xué)；E-mail：jxxia@isa.ac.cn

[本文編校：邱德勇]