趙 瀛，宋斌斌，郭 瑋，張春燕，談綺文，彭穎斐，潘柏申

(上海復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海200032)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種慢性、炎癥性致畸性疾病，全球近0.5% ～1.0%的人群患有此病，其中75%是女性患者，發(fā)病2年即可出現(xiàn)不可逆的骨關(guān)節(jié)破壞。因此，RA的早期診斷和及時治療是防止關(guān)節(jié)受到進(jìn)一步損害的關(guān)鍵。但長期以來一直缺乏一個對RA的早期診斷敏感而特異的指標(biāo)?，F(xiàn)行的1987年美國風(fēng)濕病協(xié)會(ACR)診斷標(biāo)準(zhǔn)［1-2］主要依靠臨床表現(xiàn)、X-線以及類風(fēng)濕因子(RF)的檢測，而符合此標(biāo)準(zhǔn)時患者常已出現(xiàn)骨關(guān)節(jié)破壞。同時由于RF特異性較差，在許多其他自身免疫性疾病、慢性感染或老年的健康人中都會出現(xiàn)［3-5］。所以，臨床期待找到一個更靈敏且特異性更好的預(yù)示指標(biāo)。

大量的研究發(fā)現(xiàn)早期RA患者的血清和滑膜液中存在抗環(huán)瓜絲氨酸(CCP)抗體，而且陽性患者出現(xiàn)嚴(yán)重關(guān)節(jié)損傷的概率明顯高于陰性患者［6］。所以抗CCP抗體已被作為RA早期診斷及預(yù)后判斷的重要標(biāo)志物。

隨著包被抗原和檢測技術(shù)的不斷提高，許多廠家上市推出了不同的抗CCP抗體檢測試劑，同一檢測項(xiàng)目同一樣本采用不同的檢測試劑可能會存在檢測差異，而且由于抗CCP抗體檢測缺乏國際參考物質(zhì)，目前尚未標(biāo)準(zhǔn)化。因此，這些檢測試劑本身的分析性能，以及臨床實(shí)際應(yīng)用情況成為了我們關(guān)注的焦點(diǎn)。

我們選用了羅氏、歐蒙和富純的3種抗CCP抗體檢測試劑，分別進(jìn)行了分析性能的驗(yàn)證和初步臨床應(yīng)用的評估。

材料和方法

一、對象

所有對象早晨8～9時空腹采集靜脈血5 mL，1 h內(nèi)分離血清，-80℃保存至檢測。

1.RA組 2010年7至11月復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院風(fēng)濕科門診就診的RA患者93例，其中男18例，女75例，年齡18～86歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)采用ACR的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］。

2.非RA疾病對照組 (1)各種自身免疫性疾病患者82例，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡28例、狼瘡性腎炎18例、ANCA相關(guān)性血管炎3例、干躁綜合癥7例、結(jié)締組織病7例、甲亢GRAVES病5例、溶血性貧血1例、韋格納肉芽腫1例、硬皮病2例、重癥肌無力2例、自身免疫性肝炎8例，其中男23例、女59例，年齡18～86歲;(2)骨關(guān)節(jié)炎患者36例，其中男12例、女24例，年齡26～83歲。

3.健康對照組 隨機(jī)選取復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院體檢的表面健康人群20名，其中男10名、女10名，年齡25～73歲。

二、儀器和試劑

1.試劑 (1)瑞士羅氏公司(簡稱羅氏)抗CCP抗體檢測試劑(SFDA注冊編號:國食藥監(jiān)械(進(jìn))字2009第2402350號，批號165183)及配套校準(zhǔn)品和質(zhì)控品，檢測原理為電化學(xué)發(fā)光法，Cutoff值為17 RU/mL;(2)德國歐蒙公司(簡稱歐蒙)抗CCP抗體檢測試劑(SFDA注冊編號:國食藥監(jiān)械(進(jìn))字 2008第 2402505號，批號E110729AK)及配套校準(zhǔn)品和質(zhì)控品，檢測原理為酶聯(lián)免疫吸附法，Cut-off值為5 RU/mL;(3)上海富純科新生物公司(簡稱富純)抗CCP抗體檢測試劑(SFDA注冊編號:國食藥監(jiān)械(進(jìn))字2010第2400051號，批號EC110801)及配套校準(zhǔn)品和質(zhì)控品，檢測原理為酶聯(lián)免疫吸附法，Cut-off值為25 RU/mL。測試時各試劑盒均在有效期內(nèi)。

2.儀器 Modular E170全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(羅氏公司);ST-360全自動酶標(biāo)讀數(shù)儀(上海科華生物技術(shù)有限公司);BK-W96A全自動洗板機(jī)(北京眾合百克科學(xué)儀器技術(shù)有限公司)。

三、方法

1.精密度比較 用3種試劑分別測定高、低2個濃度的樣本，每份樣本重復(fù)測定20次，計(jì)算各自批內(nèi)的均數(shù)()、標(biāo)準(zhǔn)差(s)及變異系數(shù)(CV)，了解批內(nèi)不精密度。采用3種試劑分別對該2份樣本各連續(xù)測定20 d，計(jì)算各自天間的、s及CV，了解天間不精密度。

2.線性比較 CCP高值混合血清與陰性混合血清按9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9比例稀釋，充分混勻后進(jìn)行復(fù)管檢測，所有結(jié)果取均值后進(jìn)行多項(xiàng)式回歸統(tǒng)計(jì)和線性評估［7］。

3.方法學(xué)比較 分別用3種試劑檢測CCP抗體，比較兩兩之間的相關(guān)性。

4.臨床應(yīng)用評估 分別用3種試劑檢測RA組、非RA疾病對照組和健康對照組的CCP抗體水平，對檢測結(jié)果進(jìn)行ROC曲線分析，并評價臨床RA的診斷特性。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、精密度比較

3種試劑的批內(nèi)和天間的不精密度結(jié)果見表1。各試劑的批內(nèi)和天間精密度均較好，滿足臨床應(yīng)用需要。

表1 精密度檢測結(jié)果

二、線性比較

剔除超限值后得到的3種試劑的預(yù)期值與實(shí)測值散點(diǎn)圖見圖1。3種試劑的檢測線性范圍的多項(xiàng)式回歸分析結(jié)果見表2。羅氏和歐蒙2種試劑檢測線性范圍基本覆蓋了廠商推薦的檢測范圍，而富純真實(shí)的線性范圍明顯低于廠商推薦的檢測范圍。

三、方法學(xué)比較

3種抗CCP抗體檢測試劑的相關(guān)性比較見圖2。

圖1 3種試劑線性評價

表2 3種試劑的檢測線性范圍多項(xiàng)式回歸分析

圖2 3種檢測試劑之間的相關(guān)性比較

四、臨床應(yīng)用評估

1.3種試劑檢測各組抗CCP抗體的ratio值(濃度/Cut-off值)分布見圖3。3種試劑檢測的抗CCP抗體在RA組中的濃度明顯高于非RA疾病對照組和健康對照組。

2.3種試劑的ROC曲線和診斷特性參數(shù)見圖4和表3。3種試劑間的AUC差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z 值分別為 0.27、0.89、0.63，P 均 ＞0.05)，表明診斷價值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 3種試劑檢測各組的抗CCP抗體濃度絕對值分布

圖4 3種試劑對于RA診斷的ROC曲線

表3 3種檢測試劑的診斷性能比較

討 論

抗CCP抗體作為RA的一個非常敏感且特異的指標(biāo)，疾病的早期階段即可出現(xiàn)陽性，并且具有很高的陽性預(yù)期值。為了解目前常用抗CCP抗體檢測試劑應(yīng)用情況，我們對羅氏、歐蒙、富純3種試劑的分析性能和臨床應(yīng)用進(jìn)行了評估。

在3種抗CCP抗體檢測試劑的精密度實(shí)驗(yàn)中，低濃度和高濃度樣本的批內(nèi)、天間CV均＜10%，符合定量試劑要求，均滿足臨床應(yīng)用需要，其中羅氏的電化學(xué)發(fā)光法試劑盒屬于全自動免疫分析方法，其批內(nèi)和天間CV最好，均＜3%。

在試劑檢測范圍的評估實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)EP06-A的方法評價了3種試劑的線性情況，通過多項(xiàng)式回歸方程分析發(fā)現(xiàn)3種試劑最適多項(xiàng)式均為一次多項(xiàng)式，可直接判斷為線性，進(jìn)一步進(jìn)行稀釋后得到真實(shí)的線性范圍，羅氏和歐蒙基本覆蓋了廠商推薦的檢測范圍，而富純真實(shí)的線性范圍明顯低于廠商的聲明目標(biāo)。

本研究對3種抗CCP抗體檢測試劑的檢測結(jié)果之間的相關(guān)性進(jìn)行了比較。3種試劑之間相關(guān)系數(shù)(r)均＞0.85，3種試劑之間相關(guān)性較好。特別值得一提的是歐蒙和富純2種試劑的檢測原理都是酶聯(lián)免疫吸附法，所以兩者的r高達(dá)0.97。由于這3種試劑均采用第二代重組環(huán)化的瓜氨酸肽類作為其抗原，所以避免了由于不同抗原所引起的差異，這與Coenen等［8］的研究結(jié)果一致，同時文獻(xiàn)報(bào)道相較第1代試劑而言，第2代試劑在不影響特異性的情況下提高了診斷靈敏度。但目前抗CCP抗體的檢測方法由于缺乏國際參考物質(zhì)［9］，每個廠家采用其自身校準(zhǔn)品進(jìn)行校準(zhǔn)，抗CCP抗體校準(zhǔn)品及瓜氨酸表位中的差異已經(jīng)被證實(shí)為不同方法之間可比性較差的根本原因。檢測方法間的一致性只有通過采用同種抗原才能實(shí)現(xiàn)。因此，在抗CCP抗體檢測標(biāo)準(zhǔn)化目標(biāo)未達(dá)到之前，抗CCP抗體檢測方法間不可避免存在差異，這種現(xiàn)狀會給臨床應(yīng)用尤其是不同醫(yī)療部門之間的結(jié)果比對和資料分析帶來困擾。

本研究結(jié)果證實(shí)RA組抗CCP抗體濃度明顯高于健康對照組、非RA疾病對照組。富純和歐蒙抗CCP抗體的ratio值高于羅氏。實(shí)驗(yàn)表明抗CCP抗體的檢測對于RA患者具有很高的診斷價值，且能幫助臨床醫(yī)生鑒別診斷易與RA混淆的關(guān)節(jié)炎疾病。

在非RA的自身免疫性疾病中，28例SLE的患者中出現(xiàn)2例抗CCP抗體陽性(7.1%)，18例狼瘡性腎炎的患者中有2例抗CCP抗體陽性(11.1%)，7例干燥綜合征的患者中有1例抗CCP抗體陽性(14.2%)。已有報(bào)道顯示部分非RA的自身免疫性疾病患者會出現(xiàn)抗CCP抗體陽性。Mediwake等隨訪了231位SLE患者，發(fā)現(xiàn)SLE在疾病早期階段可能出現(xiàn)與RA同樣的關(guān)節(jié)損傷和畸形，侵襲性的SLE患者抗CCP抗體陽性達(dá)到20%，而非侵襲性的SLE患者抗CCP抗體陽性率僅為0.5%［10］。所以，雖然抗CCP抗體對于RA患者具有較高的特異性，但在一些自身免疫性疾病中也可能出現(xiàn)陽性。此時建議結(jié)合臨床表現(xiàn)，且與RF聯(lián)合檢測，以便提高RA與其他疾病之間的鑒別診斷能力。

在初步臨床應(yīng)用分析中，本研究對231位受試對象的抗CCP抗體檢測結(jié)果進(jìn)行ROC曲線分析，結(jié)果顯示3種檢測試劑的AUC基本相同，診斷特性差異不明顯。ROC分析顯示3種試劑診斷性能均較好，靈敏度相似，特異性羅氏最高。為了解3種試劑的確診值及排除值，本研究計(jì)算了3種試劑在診斷中的似然比，即在有病者中得出某一篩檢實(shí)驗(yàn)結(jié)果的概率與無病者得出這一概率的比值，這能較全面客觀地反映篩檢實(shí)驗(yàn)的診斷價值。陽性似然比＞10和陰性似然比＜0.1分別是確定及排除實(shí)驗(yàn)令人信服的證據(jù)，3種試劑陽性似然比均＞10，所以對RA疾病具有明確診斷價值;然而由于抗CCP抗體在一些自身免疫性疾病中也可能出現(xiàn)陽性，所以其陰性似然比并未完全達(dá)到疾病排除的要求。采用ROC最適的Cutoff值，歐蒙和富純在不降低靈敏度的前提下，檢測特異性及陽性似然比均得以明顯提高，所以對于歐蒙和富純2種檢測試劑建議采用最適Cut-off值替代廠商推薦Cut-off值。

由于RA患者在首次就醫(yī)時通常并不完全符合RA的臨床診斷和分類標(biāo)準(zhǔn)，所以早期發(fā)現(xiàn)能幫助臨床醫(yī)生更好地進(jìn)行診斷治療。而現(xiàn)今的治療手段僅著力于抗炎治療并不能達(dá)到治愈的目的，因此在發(fā)生關(guān)節(jié)損傷之前更需要早期診斷。Rantap??-Dahlquist等［11］和 Nielen 等［12］證實(shí)了抗CCP抗體能鑒別那些無癥狀但隨后會發(fā)展成為RA的隱匿型患者，抗CCP抗體陽性比RA癥狀的出現(xiàn)早4.5個月～9年。所以，抗CCP抗體在早期診斷方面發(fā)揮著重要的作用。本研究由于資源有限，未能將患者進(jìn)行早期RA(出現(xiàn)首次癥狀之前＜1年)和已確診RA(RA診斷＞2年)的分類討論。所以在RA早期診斷方面，以上3種抗CCP抗體檢測試劑之間是否存在差異還尚待更進(jìn)一步的研究闡明。

總的來說，3種抗CCP抗體檢測試劑的分析性能均滿足臨床應(yīng)用需要，羅氏檢測系統(tǒng)的精密度略好，同時3種試劑對于RA的診斷價值也是相似的，所以抗CCP抗體不同試劑之間具有一定可比性。但試劑的標(biāo)準(zhǔn)化問題使得不同的抗CCP抗體檢測試劑的結(jié)果間不可避免存在差異，所以標(biāo)準(zhǔn)化仍是現(xiàn)今刻不容緩需要解決的難題。

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