柯玉潔,秦曉丹,李 蘭,張玉超,杜 娟,丁書茂 (華中師范大學生命科學學院,遺傳調(diào)控與整合生物學湖北省重點實驗室,湖北 武漢 430079)

甲醛是室內(nèi)主要的空氣污染物[1],世界衛(wèi)生組織已將甲醛歸類為人類致癌物 A1類.流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn),甲醛污染可能與白血病發(fā)生有關.骨髓組織是具有分化生成各種細胞的干細胞的能力動物器官組織,這些干細胞通過分化能生成各種專職血細胞.因此,骨髓對于維持機體的生命和免疫力非常重要,任何對骨髓產(chǎn)生毒害作用的因素都有可能對動物體的健康產(chǎn)生影響.Golden等[2]指出:甲醛作為潛在的人類白血病致病原,需要從多條路線上去求證其生物學合理性;其核心問題是:吸入和食入的甲醛能夠轉運到骨髓;到達骨髓的甲醛具有造血毒性.Zhang等[3]認為甲醛致白血病可能有3個機制:①同其他致白血病原因一樣,直接破壞骨髓中的干細胞;②破壞外周血中的造血干細胞或祖細胞,進而進入骨髓,最終導致白血病;③破壞鼻黏膜等組織中的多功能干細胞,通過血液進入骨髓,導致白血病的產(chǎn)生.因此,在甲醛和白血病相關性的研究中,骨髓組織就是一個非常重要的靶器官.本研究以氣態(tài)甲醛暴露為染毒方式,骨髓組織細胞為研究對象,從骨髓組織細胞分裂,DNA穩(wěn)定性,DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)(DPC)效應和相關基因表達等方面展開研究,探究甲醛暴露對骨髓細胞的毒性效應,以期對評估甲醛暴露是否能增加白血病發(fā)生的風險提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑及儀器

實驗動物為5周齡純系SPF級雄性昆明小鼠,購自湖北省預防醫(yī)學科學院動物實驗中心.

主要實驗試劑:10%甲醛溶液(Sigma 公司);Hoechst 33258熒光染料(Sigma公司).

實驗儀器:WH-2小型智能環(huán)境氣候艙(武漢市宇信科技開發(fā)有限公司);4160-2型甲醛測定儀(Interscan公司).

1.2 實驗方法

1.2.1 染毒 實驗采用仿真式暴露染毒[4],將20只小鼠,隨機分為1個對照組和3個甲醛染毒組,每組 5只小鼠.染毒組在染毒缸中連續(xù)動態(tài)染毒72h,甲醛經(jīng) WH-2型小型智能環(huán)境氣候艙調(diào)配后,持續(xù)穩(wěn)定地輸出濃度為0.5,1.0,3.0mg/m3的甲醛氣體.對照組為在相同條件下的玻璃缸中,吸入經(jīng)過濾的新鮮空氣(甲醛濃度＜0.01mg/m3).染毒期間,小鼠自由進食和飲水.

1.2.2 制備骨髓細胞樣品 染毒結束后,頸椎脫臼處死小鼠,取出雙側股骨,制備骨髓細胞懸浮液后用血細胞計數(shù)板進行細胞計數(shù),將細胞數(shù)量調(diào)節(jié)到106個/mL.

1.2.3 流式細胞術測定骨髓細胞的細胞周期 將固定好的骨髓細胞樣品處理后,上細胞流式儀,用488nm氬離子激光管,測前向、側向散色光和紅色熒光.數(shù)據(jù)記錄與分析.

1.2.4 隨機擴增多態(tài)性DNA標記(RAPD)檢測骨髓細胞的DNA穩(wěn)定性 骨髓細胞的DNA基因組提取參照文獻[5]方法.按紫外吸收法用微孔板分光光度計的DNA Quant程序進行含量測定,制備0.7%的瓊脂糖凝膠進行電泳,用凝膠成像系統(tǒng)進行結果分析.

PCR反應體系為(50μL),之后進行RAPD程序流程.實驗所用8個隨機引物如表1所示.

表1 RAPD的隨機引物Table 1 List of RAPD primers

1.2.5 DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)的檢測. DPC采用KCI—SDS沉淀法進行檢測.計算DPC系數(shù)η,以此值表示DNA和蛋白質(zhì)的交聯(lián)程度.η計算公式為:

式中:DPC定量得先制作DNA濃度的標準曲線(圖1).

圖1 DNA濃度的標準曲線Fig.1 Standard curve of DNA concentration

1.2.6 RT-PCR 骨髓細胞RNA的提取:用Trizol法提取總RNA,提取的RNA應該保存于-70℃冰箱中,或者立即進行反轉錄,具體操作參照Yaghoobi等[6]的方法.實驗所用引物序列如下:

隨后進行 PCR,選用的目的基因為CYP1B1和Nucleostemin,選用的內(nèi)參基因為β-actin 2,前后分開制膠.用凝膠成像系統(tǒng)照膠分析.數(shù)據(jù)用Origin 5.0統(tǒng)計軟件來分析,并進行t檢驗和繪圖.

2 結果與討論

2.1 甲醛暴露對骨髓組織細胞分裂周期的影響

由表2可見,氣態(tài)甲醛動態(tài)染毒對于SPF 級昆明種純系雄性小鼠的骨髓細胞細胞周期有明顯的影響作用, S期細胞含量明顯下降,而G2期細胞含量上升.對于 G1期的影響作用不顯著.S期是細胞DNA復制時期,可以推測甲醛暴露對于骨髓細胞DNA的復制過程有毒害作用;G2期的百分比回升,表明甲醛能抑制小鼠骨髓細胞進入M期,而使大量細胞停滯于 G2期.結果表明:甲醛暴露對能影響小鼠骨髓細胞的分裂與分化,甲醛對骨髓細胞生長產(chǎn)生毒害作用.

表2 甲醛暴露對骨髓細胞分裂周期的影響Table2 Formaldehyde exposure on bone marrow cell division cycle

2.2 甲醛暴露對骨髓組織細胞中遺傳物質(zhì)DNA穩(wěn)定性的影響

圖2 骨髓基因組DNA的電泳圖譜Fig.2 Gel electrophoresis of bone marrow DNA

提取的小鼠骨髓細胞DNA.通過ND-1000核酸微量定量儀檢測DNA濃度和純度,選擇OD260與OD280的比值在1.76～1.85的樣品進行DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳(圖2).圖象呈現(xiàn)單一條帶,沒有拖尾現(xiàn)象,表明此方法提取純化得到的DNA具有很高純度.以此作為PCR擴增模版.

隨機擴增多態(tài)性DNA標記技術,是在PCR技術的基礎上發(fā)展起來的,它是以細胞的DNA為模板,以一系列隨機排列的不同寡聚核苷酸單鏈為引物進行擴增.若相應部位的基因組發(fā)生損傷,出現(xiàn)缺失、增加、移位等現(xiàn)象,就會使擴增DNA片段發(fā)生變化[7].本研究中,小鼠染毒后,不同染毒濃度下基因組DNA的RAPD圖譜發(fā)生了明顯的變化.經(jīng)過統(tǒng)計(表3)發(fā)現(xiàn):甲醛處理后,0.5mg/m3染毒組多態(tài)性條帶最多,且更易導致新帶的產(chǎn)生;1.0mg/m3濃度組則有較多條帶消失;而3.0mg/m3濃度組條帶變化數(shù)目最多,且較易引起擴增條帶強度的變化;由低濃度到高濃度,變化條帶數(shù)與甲醛升高而增多.甲醛的濃度與 RAPD圖譜的變化之間呈現(xiàn)良好的劑量-效應關系,說明甲醛濃度越高對小鼠骨髓DNA的損傷越嚴重.

表3 隨機多態(tài)性擴增結果Table 3 RAPD bands of control group and each concentration group

2.3 甲醛暴露引起的骨髓組織細胞DPC效應

如圖3所示,隨著甲醛濃度的升高,小鼠骨髓細胞DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)系數(shù)逐漸升高,0.5mg/m3組與對照組存在顯著差異(P＜0.05),1.0、3.0mg/m3組與對照組存在極顯著差異(P＜0.01).表明在實驗濃度范圍內(nèi),甲醛可顯著誘導骨髓細胞DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)物的形成.

圖3 不同濃度的氣態(tài)甲醛致DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)的變化Fig.3 DNA-protein crosslinks induced by different concentrations of gaseous formaldehyde

從實驗結果可以看出,甲醛濃度與骨髓組織細胞中的DPC效應呈現(xiàn)良好的劑量-效應關系,即甲醛濃度越高,骨髓細胞中的DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)程度越重.這與上述DNA穩(wěn)定性研究的結果一致.從而可以顯示甲醛對骨髓細胞造成損傷.

本研究的結果與Heck等[8]實驗結果不同,Heck等認為吸入和食入的甲醛不能夠在體內(nèi)隨血液轉運,且甲醛暴露沒有造成骨髓組織細胞的遺傳毒性;對此本課題組分析如下:①為什么體內(nèi)甲醛濃度不隨外界甲醛濃度改變與改變.甲醛是內(nèi)源物質(zhì)之一,高濃度甲醛暴露,可能誘導甲醛脫氫酶的高效表達,加快甲醛的降解.但降解的醛基并沒有全部直接氧化生成CO2和H2O,主要是基團的轉移,即甲醛進入體內(nèi)可能與其他生物分子結合,體內(nèi)游離甲醛量沒有變,因此體內(nèi)甲醛的含量不隨外界環(huán)境甲醛含量的變化而變化.②通過同位素標記甲醛分子中的C和H,然后檢查骨髓組織中是否含有同位素標記DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)量即DPC含量并不科學.甲醛的還原性很強,易與多種物質(zhì)結合,沒有特殊載體,不可能直接運到骨髓,目前還沒有發(fā)現(xiàn)這樣的載體.檢查甲醛有沒有造成骨髓遺傳毒性,不能只檢測同位素標記的DPC,生物體有許多基團轉位酶和異構酶,吸入的甲醛分子和最后造成毒性的分子不一定是同一被標記的分子.在他們實驗中沒有檢測到同位素標記的DPC,不等于甲醛暴露沒有造成骨髓組織中DPC的形成.

2.4 甲醛暴露對骨髓組織細胞分化關鍵因子的影響

本實驗考察小鼠骨髓細胞中NS基因,CYP1B1基因的表達情況,其中NS基因,CYP1B1基因與選用的β-actin 2表達情況如圖4所示.NS基因,CYP1B1基因在各濃度組暴露下均有表達.

圖4 CYP1B1和Nucleostemin基因的RNA表達結果Fig.4 The RNA expression results of CYP1B1 and Nucleostemin

圖5 CYP1B1基因與內(nèi)參擴增產(chǎn)物的豐度比值Fig.5 The abundance ratios of CYP1B1 compared with β-actin 2

利用Origin 5.0分析NS基因,CYP1B1基因各自與內(nèi)參擴增產(chǎn)物的豐度比值,并做圖分析.圖5顯示,甲醛暴露之后,CYP1B1基因在 0.5,1.0,3.0mg/m3濃度組中表達量.與空白組相比有極顯著差異.圖6顯示,甲醛暴露之后,各濃度染毒組與空白組相比, Nucleostemin的表達量發(fā)生了改變,其中,1.0mg/m3濃度組有極顯著性升高,而0.5和3.0mg/m3濃度組則是由極顯著性降低.

細胞色素 P450(CYP)是一類亞鐵血紅素—硫醇鹽蛋白的超家族,它參與內(nèi)源性物質(zhì)和包括藥物、環(huán)境化合物在內(nèi)的外源性物質(zhì)的代謝.作為發(fā)揮藥物代謝功能的主要I相代謝酶,CYP在肝臟中最為豐富.而肝外CYP的表達與功能及其與腫瘤發(fā)生的關系是近些年研究的熱點,Nagai等[9]利用 RT-PCR技術在人類髓系白血病細胞系和淋巴細胞系中對各種CYP基因的表達做了檢測,發(fā)現(xiàn)CYP1A1、CYP1B1、CYP2A6、CYP2A7、CYP2D6和CYP2E1在所有被檢測的細胞系中均有高表達.本實驗選用CYP1B1因子進行表達研究,結果顯示,各染毒組相較空白組,表達量都有明顯增高,其中1.0 mg/m3濃度組尤為明顯.說明甲醛暴露對骨髓組織中細胞色素P450表達有影響,CYP1B1因子上調(diào),說明外源性甲醛暴露對引起骨髓組織發(fā)生癌變有關聯(lián).

圖6 Nucleostemin基因與內(nèi)參擴增產(chǎn)物的豐度比值Fig.6 The abundance ratios of Nucleostemin compared with β-actin 2

NS是一種新的p53結合蛋白,它參與干細胞和腫瘤細胞的增值調(diào)控.Ma等[10]認為NS是以P53依賴途徑調(diào)控著細胞的G1/S期的轉換.Kafienah等[11]利用小干擾RNA技術阻抑NS基因表達,發(fā)現(xiàn) NS蛋白表達與細胞周期有關.由圖6可見,甲醛暴露之后,S期細胞數(shù)明顯少于對照組,NS的表達在 1.0mg/m3濃度組比空白組有極顯著上升,0.5mg/m3和3.0mg/m3濃度組與比空白組有極顯著下降.實驗結果說明,甲醛暴露對 NS的正常表達有極顯著影響.因此我們推測甲醛暴露對骨髓的干細胞分化是有影響.

3 結語

從本次研究可以看到,甲醛暴露可以造成骨髓細胞的DNA損傷,影響細胞分裂周期,并且在不同的暴露組中,可以使相關的細胞分化因子差異性表達.這些都說明外源性甲醛暴露對小鼠骨髓組織有毒性作用. 此項研究對評估甲醛暴露是否能增加白血病發(fā)生的風險具有重要意義.然而,甲醛暴露能否導致白血病,其機制如何,還需要進行持續(xù)性地研究.

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