郭靈芝,袁興中*,曾光明,崔凱龍,黃華軍,梁運(yùn)姍,方振敏,彭 馨 (1.湖南大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,湖南 長沙 410082；2.湖南大學(xué)環(huán)境生物與控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長沙 410082；.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南 長沙 410128)

木質(zhì)素是由苯丙烷結(jié)構(gòu)單元組成的近似球狀的復(fù)雜芳香族高聚體,其較難降解,已成為地球上碳循環(huán)的限速步驟[1].木素過氧化物酶(LiP)、錳過氧化物酶(MnP)和漆酶(laccase)構(gòu)成木質(zhì)素降解體系.其中,LiP在木質(zhì)素降解過程中起關(guān)鍵作用[2].因此,研究LiP的純化方法,提高LiP酶活,對(duì)提高實(shí)驗(yàn)研究水平、實(shí)現(xiàn)其工業(yè)化生產(chǎn)及加快木質(zhì)素類廢棄物的資源化處理具有重要的意義.目前LiP的純化方法多采用鹽析沉淀、凝膠過濾層析、離子交換層析,這些方法存在操作時(shí)間長,不易放大的缺點(diǎn)[3].而逆膠束純化技術(shù)彌補(bǔ)了這些缺點(diǎn),且具有成本低,可以重復(fù)利用等優(yōu)點(diǎn),有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景,因此受到酶純化技術(shù)領(lǐng)域越來越多的關(guān)注[4].

逆膠束萃取技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種新型酶分離技術(shù).逆膠束是溶解在有機(jī)溶劑中的表面活性劑在超過臨界膠束濃度時(shí)自發(fā)形成的聚集體[5].當(dāng)含逆膠束的有機(jī)溶劑和蛋白質(zhì)水溶液接觸時(shí),蛋白質(zhì)在靜電作用和疏水作用下進(jìn)入有機(jī)相,然后再調(diào)節(jié)適當(dāng)?shù)臈l件,使蛋白質(zhì)從有機(jī)相重新反萃取到水相中,以達(dá)到純化的目的.在萃取過程中,可以通過改變pH值、離子強(qiáng)度、表面活性劑種類和濃度等因素實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)酶的選擇性萃取,因此,萃取條件對(duì)純化效果起著至關(guān)重要的作用[6-7].同化學(xué)表面活性劑相比,生物表面活性劑是一種環(huán)境友好型的天然表面活性劑,具有可生物降解性、低毒性、生物相容性、低臨界膠束濃度,高增溶能力等優(yōu)勢(shì),因此,它的應(yīng)用對(duì)于逆膠束純化技術(shù)有重要的意義[8-9].目前,對(duì)于生物表面活性劑構(gòu)建的逆膠束純化功能酶的研究較少,而關(guān)于 LiP的生物表面活性劑逆膠束純化更是鮮有報(bào)道.

本研究以鼠李糖脂(RL)為表面活性劑構(gòu)建逆膠束體系,并將其應(yīng)用于LiP的萃取,通過改變表面活性劑濃度、離子強(qiáng)度、pH值以及振蕩時(shí)間等變量的取值,獲取一個(gè)最優(yōu)萃取條件.并且對(duì)影響逆膠束體系純化過程的因素進(jìn)行了全面的分析,以期為逆膠束萃取技術(shù)提純 LiP的工業(yè)推廣提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 黎蘆醇VA(Sigma試劑,96%);鼠李糖脂RL(實(shí)驗(yàn)室自己制備);考馬斯亮藍(lán) G250(Fluka進(jìn)口,分析純);正己醇、異辛烷、無水乙醇和KCl等試劑均為市售分析純.

1.1.2 儀器 水浴恒溫振蕩器(WHY-2);紫外分光光度計(jì)(Shimadzu UV-2552, Japan);超聲波清洗儀;pH 計(jì)(PHS-2F,上海雷磁儀器廠); HZQ-C空氣浴振蕩培養(yǎng)箱;TGL-16G型離心機(jī).

1.2 方法

1.2.1 LiP粗酶液的制備 菌株黃孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium(BKM-F-1767)購自中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心.

發(fā)酵培養(yǎng)基(L-1):葡萄糖10g,維生素 B11.5mg,酒石酸銨0.2g,Tween-800.05%,大量元素液 60mL,微量元素液25mL,酒石酸緩沖液10mmol/L,pH4.5.

大量元素液(L-1):CaCl20.792g,KH2PO420g,MgSO4·7H2O 6.25g.

微量元素液(L-1):CuSO4·5 H2O 10mg,氨三乙酸 1.5g,MnSO4·7H2O 0.5g,FeSO4·7H2O 100mg,KAl(SO4)210mg, H3BO310mg,NaCl 1.0g,ZnSO4·7H2O 100mg,CoSO4·7H2O 100mg.

制備方法:500mL錐形瓶中裝液體發(fā)酵培養(yǎng)基100mL,高壓滅菌后接種孢子(4×107個(gè)/100mL),37℃,150r/min搖床培養(yǎng)6d.培養(yǎng)液經(jīng)紗布除去孢子和菌絲,10000r/min離心10min得到粗酶液.

1.2.2 萃取 將一定量的鼠李糖脂經(jīng)超聲振蕩溶于正己醇/異辛烷(V:V為1:1)的混合液,形成逆膠束溶液.前萃是將 LiP粗酶液與逆膠束溶液等體積混合,振蕩一定的時(shí)間后以10000r/min離心10min,靜置分相,留取上層有機(jī)相.后萃是將前萃后所得的有機(jī)相和等體積的含一定離子強(qiáng)度的0.1mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液混合,振蕩30min,10000r/min離心 10min,靜置分相,留取下層水相.采用紫外分光光度法分別測(cè)定所得水相中的蛋白質(zhì)含量和LiP酶活.

蛋白質(zhì)萃取率(EE)定義為:后萃水相中的蛋白質(zhì)含量與初始酶液中蛋白質(zhì)含量的質(zhì)量百分比.LiP酶活回收率(AR)定義為:后萃水相中酶含量與初始酶液中酶含量的百分比.純化倍數(shù)(PF)為后萃水相中比酶活與初始酶液的比酶活之比.

1.2.3 LiP酶活測(cè)定 取0.6mL待測(cè)酶液,同時(shí)加入0.6mL的10mmol/L藜蘆醇溶液,1.8mL 250mmol/L的酒石酸緩沖液(pH值為3.0),用0.03mL 40mmol/L的H2O2啟動(dòng)反應(yīng),總體積3.0mL,25℃反應(yīng)3min,在310nm波長下測(cè)定吸光度的變化.并以不加 H2O2的反應(yīng)體系作空白樣.一個(gè)酶活力單位(U)定義為每分鐘氧化藜蘆醇產(chǎn)生1μmol藜蘆醛所需的酶量.

1.2.4 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定和電泳 水相中蛋白質(zhì)濃度采用考馬斯亮藍(lán)染色分析法.聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)中,不連續(xù)電泳中分離膠和濃縮膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為12.5%和5%.電泳時(shí),開始采用低電壓(80V),待樣品在濃縮膠部分濃縮后,再加大電壓(120V),待指示劑達(dá)到底部邊緣時(shí)即可停止電泳.

2 結(jié)果與討論

2.1 水相酸堿度對(duì)萃取的影響

水相的pH值對(duì)萃取效率有明顯的影響, pH值能改變蛋白質(zhì)的表面電荷,決定酶蛋白帶電基團(tuán)的解離速率和所帶的靜電荷[10].圖1反映了前萃取水相pH值的變化對(duì)LiP萃取率的影響.前萃取條件:0.04mol/L KCl,2.75mmol/L RL, 30min;后萃取條件:pH值為6,0.5mol/L KCl.

圖1 前萃水相中pH對(duì)LiP酶活回收率、蛋白質(zhì)萃取率及純化倍數(shù)的影響Fig.1 Effect of aqueous phase pH during forward extraction on LiP activity recovery and extraction efficiency and purification fold

由圖1可知,當(dāng)pH值為2.0～3.0時(shí),逆膠束體系對(duì)酶的萃取率與pH值成正比.在pH值為3.0時(shí),LiP酶的回收率達(dá)到最大值 93%.因?yàn)槟婺z束萃取過程中,靜電相互作用是直接推動(dòng)力.對(duì)離子型表面活性劑,萃取需滿足蛋白質(zhì)與表面活性劑極性頭所帶電荷相反,才能形成靜電吸引作用.RL為陰離子表面活性劑,形成的逆膠束內(nèi)表面帶負(fù)電荷.當(dāng)水相pH值小于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pI)時(shí),蛋白質(zhì)分子帶凈正電荷,LiP的等電點(diǎn)為3.2～4.0[11].在前萃取過程中,pI和pH的差值越大,酶蛋白與逆膠束內(nèi)表面極性頭的靜電引力作用就越強(qiáng),萃取效果就越好[12].

當(dāng)pH值繼續(xù)增大時(shí),整個(gè)體系對(duì)蛋白質(zhì)包括對(duì) LiP的萃取率都下降.這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子與表面活性劑極性頭之間的靜電吸引力減弱造成的.但是,當(dāng)酶液的pH＞pI時(shí),酶分子帶負(fù)電荷時(shí),仍有酶被提取進(jìn)逆膠束,這說明除靜電作用外,蛋白質(zhì)還可能依靠其他作用進(jìn)入逆膠束體系,其中蛋白質(zhì)的疏水作用被認(rèn)為是最重要的原因[13].

圖2 后萃水相pH對(duì)LiP酶活回收率、蛋白質(zhì)萃取率及純化倍數(shù)的影響Fig.2 Effect of aqueous phase pH during backward extraction on LiP activity recovery and extraction efficiency and purification fold

在后萃取過程中,pH值對(duì)萃取率的影響更為明顯,如圖 2所示.蛋白質(zhì)是一種兩性電解質(zhì),若水相的pH值大于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn),則蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷,它所帶的電荷與逆膠束內(nèi)所帶的電荷性質(zhì)相同,兩者之間的靜電斥力促使溶入逆膠束的蛋白質(zhì)被萃取出來.

由圖2可知,隨著pH值的逐漸增大,酶活回收率和蛋白質(zhì)萃取率持續(xù)增加.其中,pH值從5.0增大到6.0的過程中,酶活回收率急劇提高,在pH值為7.0處達(dá)到峰值.繼續(xù)增大pH值,整個(gè)萃取效果急劇變差,可能是由于LiP在堿性環(huán)境中活力下降造成的.相對(duì)于pH值為6.0而言, pH值為7.0時(shí)酶活回收率增長量較少,而蛋白萃取率提高量較多,因此其純化倍數(shù)反而不如pH值為6.0處高,綜合考慮萃取率和純化倍數(shù),確定最佳pH值為6.0.

2.2 生物表面活性劑濃度對(duì)萃取的影響

配制不同濃度的RL逆膠束溶液,按照實(shí)驗(yàn)方法中闡述的步驟進(jìn)行前萃取和后萃取.其中,前萃取水相pH值為3.0,后萃水相pH值為6.0,其他條件同上,萃取結(jié)果如圖3所示.

圖3 前萃取RL濃度對(duì)LiP酶活回收率、蛋白質(zhì)萃取率及純化倍數(shù)的影響Fig.3 Effect of RL concentration during forward extraction on LiP activity recovery and extraction efficiency and purification fold

由圖3可見,當(dāng)RL的濃度低于2.75mmol/L時(shí),隨著RL濃度的增加,蛋白質(zhì)的萃取率和酶活回收率均有一定程度的增加,這是因?yàn)镽L濃度的增加使得逆膠束的數(shù)量增加,從而增溶的蛋白質(zhì)增多.LiP是一種相對(duì)而言較小的蛋白質(zhì)(38～43kD),這使得LiP更加容易進(jìn)入逆膠束體系,從而導(dǎo)致純化倍數(shù)的增加[14].當(dāng)RL的濃度超過2.75mmol/L時(shí),萃取效果開始變差.當(dāng)表面活性劑濃度過高時(shí),逆膠束聚集在一起使得微細(xì)胞間碰撞劇烈,從而導(dǎo)致逆膠束的變形.同時(shí),隨著表面活性劑濃度的過度增加,在水含量不變的情況下,逆膠束的尺寸減小,增大了酶蛋白進(jìn)入逆膠束中的阻力[4].類似的情況出現(xiàn)在溶菌酶[15]和納豆激酶[16]的逆膠束萃取中.因此,接下來的實(shí)驗(yàn)選擇表面活性劑RL濃度為2.75mmol/L.

2.3 離子強(qiáng)度對(duì)萃取的影響

陽離子種類(K+,Na+)和濃度對(duì)陰離子表面活性劑形成的逆膠束溶液的萃取有明顯的影響,Leodidis等[17]指出,在相同的離子強(qiáng)度下,其影響程度遵循 K+＞Na+.本次實(shí)驗(yàn)選取 K+作為陽離子,以KCl為典型代表研究離子強(qiáng)度對(duì)萃取的影響.前萃中離子強(qiáng)度對(duì)萃取效果的影響如圖 4所示,其他萃取條件同上.

圖4 前萃取KCl濃度對(duì)LiP酶活回收率、蛋白質(zhì)萃取率及純化倍數(shù)的影響Fig.4 Effect of KCl concentration during forward extraction on LiP activity recovery and extraction efficiency and purification fold

離子強(qiáng)度對(duì)萃取率的影響主要是由離子對(duì)表面活性劑的表面電荷的靜電屏蔽作用所引起[18].在前萃實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),當(dāng)鹽濃度過低時(shí),有機(jī)相和水相不能很好地分層,在界面有懸浮物.在逆膠束萃取過程中,離子起到防止兩相間的乳化,并加速兩相間分離的作用,但離子強(qiáng)度太大,可抑制蛋白質(zhì)的萃取,以至根本不能被萃取[13].從圖4可以看出,當(dāng)KCl濃度低于0.04mol/L時(shí),蛋白質(zhì)萃取率和酶活回收率均隨著離子濃度的增大呈增長趨勢(shì),但當(dāng)KCl濃度高于0.04mol/L時(shí),萃取效率急劇下降.這種現(xiàn)象主要是由于以下兩個(gè)原因:一是隨著離子濃度的增大,逆膠束內(nèi)表面的雙電層變薄,表面活性劑極性基團(tuán)之間的相互斥力減弱,逆膠束的內(nèi)徑也隨之變小,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)不易進(jìn)入;二是逆膠束內(nèi)表面雙電層變薄,減弱了帶正電的蛋白質(zhì)與陰離子逆膠束內(nèi)表面之間的靜電引力,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的萃取率下降[19].

圖5為前萃取KCl濃度為0.04mol/L時(shí),后萃取過程中KCl的濃度對(duì)萃取率的影響.從圖5可看出,隨著KCl濃度的增加,酶活回收率和蛋白質(zhì)萃取率都是先增加后降低,當(dāng) KCl濃度為0.5mol/L時(shí),萃取效果最好.這樣的結(jié)果可由雙電層理論來解釋,當(dāng)離子強(qiáng)度增大時(shí),蛋白質(zhì)與逆膠束表面之間的靜電引力減小,從而降低了酶蛋白在逆膠束中的溶解度,使之由有機(jī)相反萃取回水相[13].但是高的離子強(qiáng)度增加了離子向逆膠束體系遷移的傾向,影響蛋白質(zhì)的溶解,甚至使得蛋白質(zhì)從逆膠束中鹽析出來,導(dǎo)致蛋白質(zhì)萃取率降低[19].

圖5 后萃取水相KCl濃度對(duì)LiP酶活回收率、蛋白質(zhì)萃取率及純化倍數(shù)的影響Fig.5 Effect of KCl concentration during backward extraction on LiP activity recovery and extraction efficiency and purification fold

2.4 振蕩時(shí)間對(duì)萃取的影響

圖6 前萃振蕩時(shí)間對(duì)LiP酶活回收率、蛋白質(zhì)萃取率及純化倍數(shù)的影響Fig.6 Effect of shaking time during forward extraction on LiP activity recovery and extraction efficiency and purification fold

由于逆膠束萃取酶蛋白時(shí)必須使酶與逆膠束充分接觸,達(dá)到萃取平衡需要一定的時(shí)間,故振蕩時(shí)間對(duì)LiP的純化會(huì)產(chǎn)生一定的影響.圖6表明,萃取率隨著振蕩時(shí)間的延長不斷提高,30min后萃取基本上達(dá)到了一個(gè)平衡狀態(tài),蛋白質(zhì)的萃取沒有明顯的變化.而LiP的萃取率稍微降低了一點(diǎn),這可能是由于增溶在逆膠束里面的酶發(fā)生了構(gòu)象上的改變,延長振蕩時(shí)間時(shí),LiP有小部分失活[20-21].因此本實(shí)驗(yàn)采用的振蕩時(shí)間為30min.

2.5 SDS-PAGE電泳分析

目前 LiP粗酶液初步提純的方法多為鹽析沉淀.有研究報(bào)道[3],硫酸銨鹽析方法提純 LiP粗酶液,純化效果不明顯,僅為1.6,而逆膠束體系在最佳條件下萃取LiP,純化倍數(shù)可達(dá)2.9.兩者都可以用于工業(yè)上粗酶液的初步提純,但是后者操作時(shí)間更短,約3h,成本更低且對(duì)環(huán)境污染更少.

本實(shí)驗(yàn)將粗酶液和逆膠束溶液按最佳萃取條件進(jìn)行前萃和后萃實(shí)驗(yàn).從圖7中可以看出,粗酶液的條帶分子量有兩條,通過逆膠束萃取后水相的電泳圖譜主要集中在40kDa左右,其中包含了所需要萃取的LiP和少量的雜蛋白.綜上可知,逆膠束萃取技術(shù)對(duì) LiP粗酶液進(jìn)行了初步的提純,取得了一定的效果.

圖7 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析Fig.7 SDS-PAGE analysis 1:mark; 2:粗酶液; 3:逆膠束萃取后水相

3 結(jié)論

3.1 由生物表面活性劑構(gòu)建的逆膠束體系可用于純化木素過氧化物酶,且只需前萃和后萃兩步就可以達(dá)到純化的目的,具有提取時(shí)間短,可在室溫下進(jìn)行等優(yōu)點(diǎn).

3.2 將陰離子生物表面活性劑鼠李糖脂溶于正己醇/異辛烷(V:V為1:1)的混合液所構(gòu)建的逆膠束體系萃取 LiP,通過實(shí)驗(yàn)確定了各因素的最佳水平:[RL]=2.75mmol/L,前萃pH 值為3.0,前萃[KCl]=0.04mol/L,振蕩時(shí)間為30min,后萃pH 值為6.0,后萃[KCl]=0.5mol/L.在此條件下,酶活回收率為93%,純化倍數(shù)為2.9,電泳分析證實(shí)了純化結(jié)果.

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