王若天，鄺健輝

(1.瓊海市人民醫(yī)院，海南 瓊海 571400;2.中山大學(xué) 附屬第五醫(yī)院，廣東 珠海 519000)

大蒜素是大蒜的主要活性成分，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為三硫二丙烯，具有廣譜的抗菌、抗病毒、降血壓、降血脂的作用。近年來發(fā)現(xiàn)其還有抗癌作用［1］。5-氟尿嘧啶(5-Fu)雖已應(yīng)用于肝癌的治療，但因易產(chǎn)生耐藥而大大降低了抗癌有效性。替加氟是5-Fu的衍生物，其化療指數(shù)為5-Fu的2倍，而毒性僅為5-Fu的1/4～1/7。本研究觀察大蒜素聯(lián)合替加氟對人HepG2肝癌細(xì)胞增殖的影響，為臨床肝癌治療的聯(lián)合用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人肝癌HepG2細(xì)胞，中科院上海細(xì)胞庫;大蒜素(純度:99.5%)，上海禾豐制藥公司;替加氟注射液(5 mL∶0.2 g)，山東齊魯制藥有限公司;DMEM培養(yǎng)基，GIBCO公司;新生小牛血清，上?？婆d生物科技有限公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT)，Sigma公司。

Sunrise酶標(biāo)儀，奧地利TECAN公司;800B型低速離心機(jī)，上海安亭科技儀器廠。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞，培養(yǎng)條件:含10%小牛血清、100 u/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱待細(xì)胞呈單層生長，待培養(yǎng)瓶鋪滿75%時傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)［2］。細(xì)胞以1×104/mL接種于96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)過夜后隨機(jī)分為4組。對照組、大蒜素組(50 μg/L)、替加氟組(5 μg/mL)和聯(lián)合組(50 μg/L 大蒜素 +5 μg/mL 替加氟)，每組6復(fù)孔。每組設(shè)2個時間點(diǎn)，分別觀察24和48 h時，各組細(xì)胞增殖情況。

1.3 MTT比色法檢測各組人HepG2肝癌細(xì)胞增殖情況

分別于加藥作用24和48 h后，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，繼續(xù)孵育4 h終止培養(yǎng)，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入二甲亞砜(DMSO)100 μL，置于搖床上低速振蕩10 min，于490 nm波長處測定吸光度(A)值，細(xì)胞抑制率(IR)=1-(A藥物組/A對照組)×100%。用金氏公式進(jìn)行聯(lián)合用藥分析:q=E(a+b)/(Ea+Eb-Ea×Eb)，其中E(a+b)為合并用藥抑制率，Ea和Eb分別為A藥和B藥單用的抑制率。q值介于0.85～1.15表示藥物作用單純相加，q＞1.15～2.0說明藥物有協(xié)同作用，q＜0.85表示藥物間拮抗［3-4］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

大蒜素與替加氟對人HepG2肝癌細(xì)胞增殖的影響見表1。大蒜素組、替加氟組和聯(lián)合組A值均明顯低于對照組(P＜0.05);聯(lián)合組A值明顯低于單獨(dú)用藥組(P＜0.05);大蒜素與替加氟具有協(xié)同抑制HepG2肝癌細(xì)胞增殖的作用(q=1.45)。

3 討論

大蒜素不僅對多種真菌和細(xì)菌有較強(qiáng)的殺滅作用，而且具有抗腫瘤作用，近年研究表明，其對多種惡性腫瘤有明顯抑制作用。曾紀(jì)曉等［5］研究發(fā)現(xiàn)，500μg/L以上大蒜素能直接殺滅人HepG2肝癌細(xì)胞，50 μg/L的大蒜素具有中等抑制HepG2肝癌細(xì)胞增殖作用。

表1 大蒜素與替加氟對人HepG2肝癌細(xì)胞增殖的影響(n=6，±s)

表1 大蒜素與替加氟對人HepG2肝癌細(xì)胞增殖的影響(n=6，±s)

與對照組比較:1P＜0.05;與大蒜素組比較:2P＜0.05;與替加氟組比較:3P＜0.01

組 別 A值24 h 48 h IR/%24 h 48 h對照組0.762±0.051 0.761±0.048 - -大蒜素組0.574±0.0471 0.624±0.0331 10.35 16.50替加氟組0.414±0.0361 0.468±0.0201 27.26 34.27聯(lián)合組 0.223 ± 0.0211，2，30.314 ± 0.0371，2，354.83 46.93

為進(jìn)一步探索肝癌聯(lián)合化療途徑，本研究在細(xì)胞水平觀察大蒜素聯(lián)合替加氟對人HepG2肝癌細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，大蒜素和替加氟單獨(dú)用藥均能抑制人HepG2肝癌細(xì)胞增殖，兩藥聯(lián)合抑制細(xì)胞增殖的效果更加明顯，具有協(xié)同作用。替加氟是5-Fu的衍生物，在體內(nèi)經(jīng)肝臟活化轉(zhuǎn)換為氟尿嘧啶而發(fā)揮其抗腫瘤活性，干擾DNA與RNA合成，主要作用于S期，為細(xì)胞周期特異性藥物;其抗瘤譜與5-Fu相同，但化療指數(shù)是5-Fu的兩倍。大蒜素為百合科植物大蒜鱗莖中提取的多種烯丙基有機(jī)硫化合物，可通過上調(diào)人肝癌細(xì)胞Fas/FasL系統(tǒng)的表達(dá)及線粒體途徑來誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡［6］，兩藥聯(lián)合既能抑制肝癌細(xì)胞增殖，還促進(jìn)其凋亡。

［1］ 吳 潔，楊靜靜.大蒜素/有機(jī)凹凸棒黏土/海藻酸鈉/殼聚糖復(fù)合微球的制備及其性能［J］.中國生化藥物雜志，2011，32(6):433-436.

［2］ 任鳳蓮，陳莎子，代 軍，等.大蒜素提取檢測及對肝癌細(xì)胞的滅活效果研究［J］.光譜實(shí)驗(yàn)室，2011，28(1):374-377.

［3］ 李玉生，黃 黎，呂其軍，等.干擾素α-2b聯(lián)合5-氟尿嘧啶對人肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響［J］.山東大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2011，49(9):48-52.

［4］ 王 麗，李 娟，段成剛，等.曲古抑菌素 A與5-氟尿嘧啶協(xié)同對肝癌細(xì)胞HepG2的抑制作用［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2012，39(4):933-935.

［5］ 曾紀(jì)曉，何曉順，馬 毅，等.大蒜素對肝癌細(xì)胞生長的抑制作用［J］.中國普通外科雜志，2009，18(7):691-694.

［6］ 呂 鋒，張 園，孫 謙，等.大蒜素對人肝癌細(xì)胞HepG2的抑制和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用［J］.江蘇醫(yī)藥，2010，36(23):2810-2812.