李 銘，袁保東，廖 紅，程恒輝

(1.武漢市結核病防治所，湖北 武漢 430030;2.武漢市商業(yè)職工醫(yī)院，湖北 武漢 430021;3.華中科技大學 同濟醫(yī)學院 附屬同濟醫(yī)院病理研究所，湖北 武漢 430030)

近年來細胞因子在肺纖維化中的作用日益受到重視，結締組織生長因子(CTGF)作為轉化生長因子-β1(TGF-β1)的下游介質，對促進肺成纖維細胞表型轉化具有更強、更直接的作用［1］。已有研究表明，銀杏葉提取物(GBE)對肝、腎纖維化具有一定預防作用［2］，但對肺纖維化的作用報道甚少。本研究觀察GBE對肺纖維化大鼠肺成纖維細胞表達CTGF和肌成纖維細胞的標志產(chǎn)物α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的影響，為肺纖維化防治提供依據(jù)。

1 材料

GBE注射液(5 mL∶17.5 mg，德國威瑪舒培博士大藥廠，進口藥品注冊證號:BX20010117);RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司);小牛血清(杭州四季清生物工程有限公司);CTGF抗體(美國Santa Cruz公司);α-SMA抗體(武漢博士德生物工程有限公司)。

ALTRATM型流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特有限公司)。

健康清潔級雄性SD大鼠4只，體重(220±30)g，武漢大學動物實驗中心提供，合格證號:SCXK鄂2010-0003。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)及分組

大鼠氣管內(nèi)一次性滴注5 mg/kg博來霉素A5后14 d，將大鼠麻醉后處死，低溫下取出肺臟，組織塊法原代培養(yǎng)肺成纖維細胞，24 h內(nèi)貼壁細胞即為肺成纖維細胞，細胞鑒定采用免疫細胞化學法(SP法)檢測Vimentin表達。添加含有10% 小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱。5～7 d后傳代，選擇第4代細胞用于試驗。細胞分組:對照組、GBE 高、中、低劑量(25，50，100 mg/L)組，分別加入相應濃度的GBE共培養(yǎng)24 h。

2.2 SP法檢測CTGF

制備細胞爬片，常規(guī)SP法檢測成纖維細胞表達CTGF，用圖像分析儀行半定量分析，每一玻片任選5個視野檢測細胞積分光密度值，獲得平均積分吸光度值［3］。

2.3 流式細胞術檢測α-SMA

胰蛋白酶消化第4代細胞，用4℃的75%乙醇溶液固定，每份樣品含5×105個細胞，采用流式細胞儀檢測α-SMA值，檢測單個成纖維細胞表達α-SMA的水平。

2.4 統(tǒng)計學分析

3 結果與討論

GBE對大鼠肺成纖維細胞表達 CTGF和 α-SMA的影響見表1。25 mg/L GBE組CTGF和α-SMA表達與對照組比較無明顯差異;50和100 mg/L GBE組CTGF和α-SMA的表達均明顯低于對照組;100 mg/L GBE組表達低于50 mg/L組(P＜0.05)。

近年研究表明，成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞，合成大量膠原等細胞外基質成分，同時細胞外基質降解減少是肺纖維化發(fā)生的主要原因［4］。α-SMA是成纖維細胞表型向肌成纖維細胞分化的標志。銀杏葉的主要成分為黃酮類和內(nèi)酯化合物，具有清除氧自由基的作用［5］。

表1 GBE對大鼠肺成纖維細胞表達CTGF和α-SMA的影響

本研究結果提示，GBE對纖維化大鼠肺成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞具有一定抑制作用。GBE是一種天然活性物質，其有效成分為黃酮甙及銀杏內(nèi)酯，黃酮甙具有明顯的抗氧化和自由基清除活性。而肺纖維化進程中，氧自由基生成過多導致NO等大量生成是肺纖維化形成的促發(fā)因素之一，所以推測GBE對肺纖維化大鼠肺成纖維細胞表型轉化的抑制作用可能與其清除一氧化氮等自由基有關?？傊?，GBE對肺纖維化大鼠肺成纖維細胞表型轉化具有一定抑制作用，其具體機制還有待進一步研究。

［1］ 雷賢華，鮑 敏，甄海寧.腫瘤壞死因子-α對大鼠肺成纖維細胞表達結締組織生長因子的影響［J］.中國生化藥物雜志，2010，31(5):340-342.

［2］ 李相軍，王 丹，石 艷，等.銀杏葉提取物對體外培養(yǎng)大鼠腎成纖維細胞作用的實驗研究［J］.中國實驗診斷學，2010，14(1):45-47.

［3］ 陳 琳，魏路清.阿托伐他汀對TGF-β1誘導的大鼠肺成纖維細胞分化的影響［J］.武警醫(yī)學院學報，2009，18(2):93-96，100.

［4］ 譚明旗，董晨光，魏路清，等.阿托伐他汀對轉化生長因子β1誘導的大鼠肺肌成纖維細胞分化的影響［J］.中國醫(yī)科大學學報，2008，37(4):505-508.

［5］ 潘尚領，劉承武，黃齡瑾，等.銀杏葉提取物對人胚肺成纖維細胞氧化應激的保護作用［J］.中國老年學雜志，2007，27(12):1128-1130.