王若天，錢 明，田 園

(1.瓊海市人民醫(yī)院，海南 瓊海，571400;2.中山大學(xué) 附屬第五醫(yī)院，廣東 珠海，519000;3.華中科技大學(xué) 同濟(jì)醫(yī)學(xué)院 附屬武漢中心醫(yī)院，湖北 武漢 430014)

胰腺癌惡性程度高，進(jìn)展快，具有發(fā)現(xiàn)晚、病程短、轉(zhuǎn)移早、預(yù)后差等特點(diǎn)，號(hào)稱“癌中之王”［1］。吉西他濱是治療進(jìn)展期胰腺癌首選的化療藥物，但由于胰腺癌細(xì)胞獲得性或內(nèi)在的耐藥性使其總有效率不足20%。近年來吉西他濱聯(lián)合非細(xì)胞毒藥物以增強(qiáng)其化療敏感性成為研究熱點(diǎn)。本研究在細(xì)胞水平觀察姜黃素聯(lián)合吉西他濱對(duì)人胰腺癌Panc-1細(xì)胞增殖的影響，為臨床用藥提供參考。

1 材料

姜黃素(純度≥98%，美國Sigma公司);吉西他濱(純度≥97%，美國禮來公司);CCK-8試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所);RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司);小牛血清(杭州四季清生物工程有限公司)。

人胰腺癌Panc-1細(xì)胞株(中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所)。

Labexim LMR SA型酶標(biāo)儀(奧地利)。

2 方法

2.1 溶液配制

姜黃素溶液:稱取姜黃素0.368 g，用少量二甲亞砜(DMSO)溶解，再用三蒸水稀釋至100 mL，用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋至60 μmol/L，4℃避光保存［2］。吉西他濱溶液:用無菌生理鹽水配成0.2 mol/L，再用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋至20 μmol/L。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

Panc-1細(xì)胞株培養(yǎng)于含10% 小牛血清、100 μg/mL青霉素和 100 μg/mL鏈霉素的 RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37℃，飽和濕度，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞單層貼壁，生長至70% ～80% 融合時(shí)用胰蛋白酶消化傳代。分為4組:對(duì)照組(培養(yǎng)液)、姜黃素組(60 μmol/L)、吉西他濱組(20 μmol/L)、聯(lián)合組(60 μmol/L姜黃素+20 μmol/L吉西他濱)。

2.3 CCK-8法檢測各組Panc-1細(xì)胞增殖抑制率

Panc-1細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以4×103個(gè)/孔接種到96孔板，每孔100 μL，貼壁后，按照細(xì)胞分組加入不同的藥物溶液200 μL，對(duì)照組加含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24，48和72 h，各6復(fù)孔。藥物作用結(jié)束前 1 h，各孔加入 CCK-8 0.01 mL，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，同時(shí)設(shè)置空白組 (用磷酸鹽緩沖液代替細(xì)胞懸液和藥物溶液)，用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的吸光度(A)值，細(xì)胞存活率(%)=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白)/(A對(duì)照組-A空白)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用重復(fù)測量的方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

3 結(jié)果

結(jié)果見表1。姜黃素組、吉西他濱組和聯(lián)合組的A值均明顯低于對(duì)照組(P＜0.05或0.01);聯(lián)合組A值顯著低于姜黃素組和吉西他濱組(P＜0.05);聯(lián)合組的細(xì)胞存活率均明顯比單獨(dú)用藥組低。姜黃素和吉西他濱單獨(dú)作用以及姜黃素聯(lián)合吉西他濱組均能明顯抑制Panc-1細(xì)胞增殖，呈時(shí)間依賴性;姜黃素聯(lián)合吉西他濱組抑制Panc-1細(xì)胞增殖作用明顯強(qiáng)于任一單獨(dú)用藥組，且呈時(shí)間依賴性。

4 討論

表1 姜黃素聯(lián)合吉西他濱對(duì)人胰腺癌Panc-1細(xì)胞增殖的影響(n=3)

姜黃素是從姜科植物姜黃中提取的β-二酮多酚類化合物，具有抑制癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的抗癌活性，最近被認(rèn)為是一種潛在的第3代抗癌化療藥。已有研究表明，姜黃素能有效抑制人類胰腺癌細(xì)胞株SW1990增殖［3］，但其是否能增強(qiáng)化療藥物對(duì)胰腺癌細(xì)胞Panc-1的作用報(bào)道甚少。

曾勇等［4］對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株BxPC-3的研究表明，大黃素聯(lián)合吉西他濱對(duì)BxPC-3細(xì)胞增殖具有明顯抑制作用，且強(qiáng)于任一單獨(dú)用藥。本研究進(jìn)一步觀察姜黃素聯(lián)合吉西他濱對(duì)人胰腺癌Panc-1細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果姜黃素和吉西他濱單獨(dú)用藥可以抑制Panc-1細(xì)胞增殖，兩藥聯(lián)合應(yīng)用抑制細(xì)胞增殖的作用明顯強(qiáng)于單獨(dú)用藥組。分析聯(lián)合用藥的優(yōu)勢:①姜黃素能同時(shí)作用于人胰腺癌Panc-1細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、合成蛋白等多個(gè)靶點(diǎn)，從多個(gè)環(huán)節(jié)抑制癌細(xì)胞生長;②胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱耐藥與其核因子-κB(NF-κB)處于高度活化狀態(tài)有密切關(guān)系，IκBα的磷酸化是NF-κB活化的關(guān)鍵步驟。姜黃素可以通過下調(diào)IκBα磷酸化，減少Panc-1細(xì)胞NF-κB阻抑物IκBα 蛋白，從而降低 NF-κB 活性［5］?？傊?，姜黃素聯(lián)合吉西他濱對(duì)人胰腺癌Panc-1細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，其具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

［1］ 朱志霞，張為民，賈 剛，等.吉西他濱與培美曲塞對(duì)人胰腺癌細(xì)胞BXPC-3及PANC-1生長的體外作用［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30(1):149-152.

［2］ 徐克平，吳延虎，陳亦江.姜黃素抑制食管癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡［J］.江蘇醫(yī)藥，2007，33(5):469-470.

［3］ 楊 芳，趙 秋，王 渝，等.姜黃素抑制STAT3信號(hào)通路對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖的影響［J］.世界華人消化雜志，2011，19(30):3149-3153.

［4］ 曾 勇，劉 岸，童洪飛，等.大黃素聯(lián)合吉西他濱對(duì)體外人胰腺癌細(xì)胞株BxPC-3生長及凋亡的影響［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011，31(4):552-554.

［5］ 田 芳，柴玉榮，江亞南，等.姜黃素通過下調(diào) IκBα磷酸化抑制食管鱗癌細(xì)胞的體外增殖［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2011，31(7):767-772.