張繼國，王 藝，張 靜，邱彥龍

(泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271016)

癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)的常見疾病，是反復(fù)發(fā)作的腦神經(jīng)元的高度同步放電所導(dǎo)致的暫時(shí)性腦功能失調(diào)，發(fā)作時(shí)具有多種行為或運(yùn)動(dòng)方面的表現(xiàn)。癲癇發(fā)作后腦損傷的機(jī)制尚未闡明，有觀點(diǎn)認(rèn)為細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致腦損傷的重要環(huán)節(jié)之一［1-2］。我們既往的研究證實(shí)靈芝孢子粉能夠明顯降低杏仁核點(diǎn)燃大鼠海馬TNF-α mRNA和IL-6 mRNA的表達(dá)，對(duì)癲癇發(fā)作導(dǎo)致的大腦神經(jīng)元損傷有明顯的保護(hù)和治療作用［3］。本研究以杏仁核點(diǎn)燃模型大鼠為研究對(duì)象，觀察靈芝孢子粉對(duì)預(yù)處理后大鼠神經(jīng)元凋亡的影響，為防治癲癇導(dǎo)致的腦組織損傷提供依據(jù)。

1 材料

靈芝孢子粉(靈芝寶爾)，購自山東寶來利來生物工程股份有限公司。

原位末端標(biāo)記檢測(cè)(TUNEL)試劑盒德國寶靈曼公司。

SEY-3201電子刺激器;腦立體定位儀(江灣I型C);SMUP-PC四道生物信號(hào)微機(jī)處理系統(tǒng)。

雄性大鼠Wistar 24只，體質(zhì)量180～300 g，山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):魯動(dòng)質(zhì)字200001001。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型的建立

雄性Wistar大鼠24只，按文獻(xiàn)［3］方法建立杏仁核點(diǎn)燃模型。

2.2 分組及治療

模型大鼠隨機(jī)分成靈芝孢子粉組、陰性對(duì)照組和陽性對(duì)照組3組，每組8只。靈芝孢子粉組給予30 mg/mL靈芝孢子粉(用生理鹽水配制)10.0 mL/kg，陰性對(duì)照組給予生理鹽水，陽性對(duì)照組給予苯巴比妥(35 mg/kg)，均灌胃給藥，1次/d，給藥2周。

2.3 檢測(cè)方法

處死大鼠，1%多聚甲醛心臟灌注取腦海馬組織、石蠟包埋連續(xù)冠狀切片，采用原位雜交末端標(biāo)記(TUNEL)試劑盒，按說明書進(jìn)行操作。切片常規(guī)脫蠟后乙醇逐級(jí)脫水，蛋白酶K消化(37℃，30 min)，磷酸鹽緩沖液清洗后滴加TUNEL反應(yīng)液(TDT緩沖液 8 μL，2 mmol/L Bio-dUTP 溶液 3 μL，TDT 酶0.4 μL，三蒸水 28.6 μL)，37 ℃，2 h;滴加復(fù)合液，37℃，1 h;DAB顯色5～20 min(鏡下監(jiān)測(cè))，顯色滿意后終止反應(yīng);蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明，中性樹脂封片、鏡下觀察。每只大鼠取2張切片，100倍光鏡下對(duì)TUNEL陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2.4 統(tǒng)計(jì)處理

3 結(jié)果

TUNEL陽性細(xì)胞核染色呈棕黃色，核固縮呈不規(guī)則形或圓形，高倍鏡下可見染色質(zhì)深染聚集成塊或碎裂、核邊集。陽性對(duì)照組和靈芝孢子粉組大鼠凋亡細(xì)胞與陰性對(duì)照組比較明顯減少(P＜0.05)，陽性對(duì)照組和靈芝孢子粉組之間無明顯差異(P＞0.05)。見表1。

表1 TUNEL法檢測(cè)大鼠腦組織細(xì)胞凋亡結(jié)果(n=8，±s)

表1 TUNEL法檢測(cè)大鼠腦組織細(xì)胞凋亡結(jié)果(n=8，±s)

與陰性對(duì)照組比較:1P＜0.05

組 別 凋亡細(xì)胞數(shù)/(個(gè)/mm2)陰性對(duì)照組42.08±4.29陽性對(duì)照組 21.25±4.031靈芝孢子粉組 23.17±3.731

4 討論

藥物治療是目前治療癲癇的主要方式，西醫(yī)抗癲癇藥物雖可使大多數(shù)患者的病情得以控制，但其毒副作用較大。中醫(yī)中藥以其療效穩(wěn)定，無明顯毒副作用等優(yōu)勢(shì)，越來越引起國內(nèi)研究者的重視。

靈芝是擔(dān)子菌綱多孔菌科(Polyproraceae)靈芝屬(Ganoderma)真菌赤芝(G.lucidum Karst)和紫芝(G.japonicum Lloyd)的總稱，一種珍貴的藥用真菌，具有扶正固本等功效。靈芝發(fā)育后期彈射釋放出來靈芝孢子粉(Ganoderma Lucidum Spore)含有蛋白質(zhì)和氨基酸類、糖肽類、維生素類、甾醇類、三萜類、生物堿類、脂肪酸類、內(nèi)酯和無機(jī)離子等良好的生物活性物質(zhì)［4-5］，在臨床主要用于抗腫瘤、抗心血管系統(tǒng)疾病、解毒保肝和調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)［6］。近年來，進(jìn)行了大量試驗(yàn)充分顯示了靈芝孢子粉對(duì)癲癇治療的優(yōu)勢(shì)并對(duì)其可能機(jī)理進(jìn)行了研究［7-8］。

癲癇的發(fā)病機(jī)制目前還不完全清楚，涉及很多因素包括多種基因的表達(dá)異常、腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)釋放異常、細(xì)胞凋亡等。細(xì)胞凋亡可能是癲癇患者腦神經(jīng)元死亡的一種重要方式，對(duì)癲癇的發(fā)病起著重要的作用。本研究結(jié)果顯示，癲癇發(fā)作可導(dǎo)致海馬神經(jīng)元的凋亡增多，而靈芝孢子粉可明顯減少和下調(diào)杏仁核點(diǎn)燃大鼠腦組織細(xì)胞凋亡，對(duì)癲癇發(fā)作導(dǎo)致的大腦神經(jīng)元凋亡有明顯的保護(hù)作用。

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［3］ 張繼國，王 藝，張 靜.靈芝孢子粉對(duì)杏仁核點(diǎn)燃模型大鼠神經(jīng)元的功能性保護(hù)作用及機(jī)制［J］.中國生化藥物雜志，2012，33(2):145-147.

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