劉文其，袁 堃，康 敏，范小玲，毛 艷

(廣西醫(yī)科大學(xué) 1.第一附屬醫(yī)院 放療科，2.研究生學(xué)院 廣西 南寧 530021)

放射治療是胸部惡性腫瘤的主要治療手段之一，隨著放療設(shè)備不斷更新、放療技術(shù)不斷提高，周圍的正常組織得到了較好的保護(hù)，但在胸部惡性腫瘤在放療時(shí)肺組織仍會(huì)因受到照射不可避免地造成放射性肺損傷［1］。基礎(chǔ)和臨床研究也表明，放射性肺損傷不僅僅是單一靶細(xì)胞損傷的結(jié)果，而是一個(gè)有多種細(xì)胞參與，多種細(xì)胞因子調(diào)控的復(fù)雜過程。為此，建立放射性肺損傷的小鼠動(dòng)物模型，進(jìn)一步探索放射性肺損傷的發(fā)生機(jī)制十分必要。本實(shí)驗(yàn)通過不同劑量分割模式照射Wistar大鼠右肺來建立放射性肺損傷模型，動(dòng)態(tài)觀察不同劑量分割模式照射對(duì)大鼠放射性肺損傷的影響。

1 材料

大鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)定量檢測試劑盒和鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)定量檢測試劑盒，購自美國R＆D公司。

X線模擬定位機(jī)、60Co-γ射線放射治療機(jī)，德國西門子公司。

健康成年SPF級(jí)雄性Wistar大鼠90只，體重180～200 g，由廣西醫(yī)學(xué)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):0006586。

2 方法

2.1 分組

用5%苦味酸溶液涂染動(dòng)物背部被毛，并采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠90只隨機(jī)分為小分次照射組、大分次照射組和對(duì)照組，每組30只。

2.2 動(dòng)物的麻醉、固定及照射

常規(guī)消毒皮膚后，采用10%水合氯醛溶液400 mg/kg進(jìn)行腹腔注射麻醉。將麻醉后的大鼠保持仰臥位、四肢伸直外展，用棉線將四肢固定于木板上，然后模擬機(jī)下定位，鉛塊遮擋左肺及縱隔，然后照射組大鼠均采用60Co-γ射線照射右肺，SSD=100 cm，右肺照射野2 cm×3 cm。小分次照射組2 Gy/次，每周照射5次，共15次;大分次照射組10 Gy/次，每周照射1次，共3次;照射總量均為30 Gy。對(duì)照組大鼠只麻醉不進(jìn)行照射。

2.3 取材及檢測

3 組大鼠分別于照射后 1，3，5，10，24 周末，各組每次隨機(jī)抽取6只，稱重記錄后，用10%水合氯醛溶液400 mg/kg腹腔麻醉，從大鼠下腔靜脈抽取血液5 mL，靜置30 min，4℃，3 000 r/min離心10 min，取血清，在-80℃凍存。

抽完血后迅速切開胸腔，分離主支氣管、食管及心臟大血管等，將雙肺組織取出，將右肺組織置于提前準(zhǔn)備好的浸有生理鹽水的紗布上，然后切取右肺中葉組織3塊浸于10%福爾馬林溶液中固定24 h，按常規(guī)方法制作石蠟切片行HE常規(guī)染色，比較觀察各組肺組織病理學(xué)變化。

采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)，按試劑盒說明書進(jìn)行操作，檢測血清TGF-β1、TNF-α含量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 大體標(biāo)本觀察

大分次照射組照射后第1周肺葉腫脹，少量新鮮出血點(diǎn)，質(zhì)軟，彈性較好;第3周肺組織充血水腫，表面見點(diǎn)片狀出血灶;第5周肺表面呈暗紅色，見少量的白色點(diǎn)狀改變;第10周肺葉腫脹已經(jīng)消失，表面有微小凹陷，質(zhì)脆，可見明顯散在瘀斑;第24周后肺葉體積縮小，呈灰黃色或灰白色，表面凹凸不平，質(zhì)硬，彈性差。

小分次照射組照射后第5周肺表面可見少量的白色點(diǎn)狀改變，其余時(shí)間大鼠肺組織表面光滑、飽滿，質(zhì)稍軟，彈性較好，呈粉紅色。

對(duì)照組肺葉外觀無異常，表面光滑、飽滿，質(zhì)軟，彈性好，呈粉紅色。

3.2 病理形態(tài)學(xué)改變(光鏡觀察)

大分次照射組照射后第1周，肺組織毛細(xì)血管充血、水腫，少許炎癥細(xì)胞浸潤(圖1A1);照射后第3周，為急性炎癥表現(xiàn)，肺間質(zhì)及肺毛細(xì)血管充血、出血，肺泡間隔增厚，肺間質(zhì)水腫伴有少量紅細(xì)胞滲出，可見較多的炎細(xì)胞浸潤(圖1A2);照射后第5周，急性炎癥加重，肺間質(zhì)及肺毛細(xì)血管擴(kuò)張充血、出血，部分肺泡腔積液并有大量紅細(xì)胞聚積，大量炎癥細(xì)胞浸潤，部分肺泡壁斷裂，肺泡結(jié)構(gòu)塌陷紊亂、融合(圖1A3);照射后第10周，以增生為主，表現(xiàn)為間質(zhì)細(xì)胞數(shù)增生較前顯著，小靜脈擴(kuò)張，小動(dòng)脈管壁增厚纖維化，肺泡腔泡沫細(xì)胞浸潤，近肺被膜區(qū)域肺泡組織出現(xiàn)萎縮、塌陷，并有輕微肺泡間質(zhì)纖維化表現(xiàn)(圖1A4)。照射后第24周，表現(xiàn)為肺間質(zhì)主要被纖維和膠原組織代替，肺泡腔狹窄甚至消失，外周可見少量巨噬細(xì)胞以及中性粒細(xì)胞浸潤，管壁增厚纖維化，肺泡腔泡沫細(xì)胞浸潤(圖1A5)。

小分次照射組僅在照射后第5周時(shí)，可見在照射區(qū)內(nèi)出現(xiàn)輕微水腫增厚，炎癥細(xì)胞浸潤，并沒有出現(xiàn)明顯的水腫、充血灶;照射后第24周時(shí)，局部視野下可見少量纖維沉著，纖維化程度非常輕微，但與對(duì)照組比較差異不大(圖2)。

綜上，大分次照射組大鼠肺組織病理變化呈進(jìn)行性發(fā)展過程，經(jīng)歷炎癥期、增生期和纖維化期，損傷的程度明顯較小分次照射組嚴(yán)重;而小分次照射組照射后早期僅出現(xiàn)較輕微充血、水腫、炎癥細(xì)胞浸潤，后期僅有少量纖維沉著，肺組織損傷非常輕微，接近正常大鼠肺組織。

圖1 大分次照射組各期肺組織病理病理變化(HE×400)

圖2 小分次照射組各期肺組織病理病理變化(HE×400)

3.3 大鼠血清中TGF-β1的變化

結(jié)果見表1和圖3。大分次照射組血清中TGF-β1含量從第1周開始呈線性增長，至第5周后其增長幅度減小，第5周到第24周，血清中TGF-β1含量基本維持在一較高水平。小分次照射組血清中TGF-β1變化幅度較小，從第1周開始，血清中TGF-β1含量緩慢上升，到第5周時(shí)達(dá)到峰值，而后又緩慢下降，到第24周時(shí)已基本回落至正常水平。

表1 3組血清TGF-β1含量比較(±s，n=6)

表1 3組血清TGF-β1含量比較(±s，n=6)

與對(duì)照組比較:1P＜0.05;與小分次照射組比較:2P＜0.05

組 別 TGF-β1(ng/L)1周 3周 5周 10周 24周對(duì)照組 7.01±1.74 8.49±1.68 8.37±1.46 8.62±1.24 8.15±1.24大分次照射組 9.16±1.14 10.58±2.522 10.72±1.752 9.73±1.592 8.79±1.162小分次照射組 10.35±1.45 15.40±1.661 20.91±1.911 21.36±1.471 20.88±1.331

比較各組血清TGF-β1的含量發(fā)現(xiàn)，大分次照射組血清中TGF-β1含量在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均高于對(duì)照組和小分次照射組;但在第1周時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，自第3周起至第24周，含量均明顯高于對(duì)照組和小分次照射組(P＜0.05);而小分次照射組血清中TGF-β1含量與對(duì)照組比較，自第1周起至第24周兩組間無顯著差異(P＞0.05)。

圖3 3組血清TGF-β1含量變化曲線

3.4 大鼠血清中TNF-α的變化

結(jié)果見表2和圖4。大分次照射組血清中TNF-α含量的變化呈拋物線，即從放療后第1周開始，含量迅速升高，到第5周時(shí)達(dá)到峰值，此后迅速下降，到第24周時(shí)已接近正常水平。小分次照射組血清中TNF-α含量亦呈拋物線變化，即從放療后第1周開始，含量由低位水平迅速上升，到第5周時(shí)達(dá)到峰值，而后迅速下降到第24周時(shí)已接近正常水平。

表2 3組血清TNF-α 含量比較(±s，n=6)

表2 3組血清TNF-α 含量比較(±s，n=6)

與對(duì)照組比較:1P＜0.05;與小分次照射組比較:2P＜0.05

組 別 TNF-α(ng/L)1周 3周 5周 10周 24周對(duì)照組 71.10±8.52 67.76±4.43 68.98±3.78 70.35±5.70 68.02±6.22大分次照射組 73.20±7.63 95.06±9.061 99.83±4.031，294.46±4.031 70.38±7.66小分次照射組 80.66±6.70 102.48±7.011113.57±6.341105.67±7.79174.00±6.94

圖4 3組血清TNF-α含量變化曲線

比較不同劑量分割模式照射組血清TNF-α含量變化可見，大分次照射組血清中TNF-α含量在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均高于對(duì)照組和小分次照射組。在放療第1周時(shí)，大分次照射組血清中TNF-α含量與對(duì)照組相近(P＞0.05)，自第3周起至第10周，則明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。大分次照射組血清TNF-α含量與小分次照射組比較，僅第5周時(shí)明顯高于小分次照射組(P＜0.05);在第1和24周時(shí)，兩者無顯著差異(P＞0.05)。自第3周起至第10周時(shí)，小分次照射組血清中TNF-α含量明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。

4 討論

TGF-β是一種多功能的細(xì)胞因子，肺臟是富含TGF-β的器官之一。TGF-β由血小板、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生，它能促進(jìn)成纖維細(xì)胞趨化，產(chǎn)生膠原和纖維連接蛋白，抑制膠原降解，在組織器官的纖維化中發(fā)揮了十分重要的作用，被公認(rèn)為纖維化形成與發(fā)展的啟動(dòng)樞紐，是關(guān)鍵性細(xì)胞因子。TGF-β有TGF-β1、TGF-β2 和 TGF-β3 三種亞型，而人體內(nèi)以TGF-β1為主。TGF-β1主要作用為:①趨化并促進(jìn)成纖維細(xì)胞分裂增殖及成熟分化;②刺激成纖維細(xì)胞合成膠原蛋白，以增加肺間質(zhì)的膠原成分。同時(shí)可抑制膠原蛋白酶及纖溶酶原激活物的合成，減少肺間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解;③趨化炎性細(xì)胞及單核巨細(xì)胞，合成釋放 PDGF、TNF、IL-1、IL-6 等細(xì)胞因子，擴(kuò)大生物效應(yīng)［2］。肺受照射后 TGF-β1既能促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖又加速纖維細(xì)胞系統(tǒng)終末分化，導(dǎo)致間充質(zhì)細(xì)胞和成纖維化細(xì)胞之間比例失衡，成纖維細(xì)胞積聚導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化形成。因此，TGF-β1被認(rèn)為在放射性肺損傷中起到了至關(guān)重要的作用［3-5］。

本研究中，兩照射組的大鼠照射后第1周血清TGF-β1含量都接近正常，此時(shí)肺組織的放射性損傷也處于早期的炎癥期，損傷比較輕微。隨后血清中TGF-β1含量迅速增長，而肺的急性放射性炎癥改變也逐漸加重，到第5周血清中TGF-β1含量達(dá)到高峰時(shí)肺的急性炎癥病理改變同時(shí)到達(dá)最嚴(yán)重，尤以大分次照射組明顯。從本實(shí)驗(yàn)看出大鼠肺照射后血清TGF-β1含量與肺組織的炎癥程度呈正相關(guān)，隨著TGF-β1的逐漸升高，肺組織的病理損傷也逐漸加重。而隨著放射性肺損傷發(fā)展的進(jìn)程，在第10周以后肺組織開始了逐漸纖維化的過程，血清中TGF-β1含量一直維持在一較高水平(第5～24周)，結(jié)果表明血清中TGF-β1對(duì)放射性肺損傷引起的后期纖維化起到非常重要的作用。因此TGF-β1不僅對(duì)早期放射性損傷引起的急性炎癥起到積極作用，而且對(duì)后期肺組織纖維化的形成發(fā)揮了重要作用。

TNF-α是細(xì)胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的啟動(dòng)因子，在正常組織炎癥和纖維化的發(fā)生發(fā)揮重要作用。在TNF-α的作用下，血管內(nèi)皮細(xì)胞的反應(yīng)性改變、前列腺素的合成增加、凝血酶原調(diào)節(jié)蛋白受抑，引起微血管內(nèi)凝血，同時(shí)TNF-α發(fā)揮趨化作用，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞的滲出，啟動(dòng)炎性反應(yīng)。此外還誘發(fā) IL-1、IL-6、MCP等細(xì)胞因子的合成釋放，產(chǎn)生細(xì)胞因子的瀑布效應(yīng)，因此TNF-α被認(rèn)為在放射性肺炎的發(fā)病機(jī)制起著關(guān)鍵作用。Rube等［6］的研究表明，C57BL小鼠接受12Gy照射后，其肺組織中TNF-α等炎性因子存在一個(gè)雙向升高的表達(dá)峰，第1個(gè)峰值出現(xiàn)在照射后數(shù)小時(shí)內(nèi)(1～6 h)，這表明細(xì)胞因子的表達(dá)比先前認(rèn)為的要早的多;而第2個(gè)峰出現(xiàn)在照射后8周左右，這正好同組織病理學(xué)上的急性放射性肺炎出現(xiàn)的時(shí)間相吻合。Zhang等［7］通過抑制TNF-α的釋放來干擾放射性肺損傷的發(fā)生，發(fā)現(xiàn)射線誘導(dǎo)TNF-α的釋放與早期的細(xì)胞死亡和潛在的肺損傷有關(guān)系。

本研究中，大鼠血清中TNF-α含量在照射后第1周處于一個(gè)較低水平，與對(duì)照組接近，此時(shí)肺組織的放射性損傷也處于早期的炎癥期，損傷比較輕微。隨后肺的急性放射性炎癥改變也逐漸加重，這時(shí)血清中TNF-α含量由低位水平迅速升高。隨著放射性肺損傷的發(fā)展，在第10周以后肺組織的逐漸纖維化的過程中血清中TNF-α含量卻回落至正常水平(第10～24周)，結(jié)果提示血清中TNF-α對(duì)后期放射性肺損傷引起的肺纖維化沒有發(fā)揮作用。由此可見，大鼠肺照射后血清中TNF-α僅與急性炎癥的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。

本研究采用不同劑量分割模式照射下，大分次照射組和小分次照射組血清中TGF-β1含量都是從放療結(jié)束后第1周開始上升，但小分次照射組卻在第5周達(dá)到峰值，而大分次照射組血清中TGF-β1含量在第10周達(dá)到高峰。在這段時(shí)間內(nèi)，兩組大鼠肺組織的病理改變均表現(xiàn)為急性炎癥反應(yīng)，但小分次照射組嚴(yán)重程度較大分次照射組輕。與此同時(shí)，小分次照射組血清中TGF-β1含量也明顯低于大分次照射組，且在第3～10周時(shí)兩組血清中TGF-β1含量的有顯著差異(P＜0.05);第24周時(shí)，大分次照射組大鼠肺組織出現(xiàn)了嚴(yán)重的不可逆的纖維化，而小分次照射組僅出現(xiàn)極輕微的纖維化。表明在接受相同總劑量照射時(shí)，大分次照射組無論是早期的放射性肺炎還好晚期的纖維化都明顯比小分次照射組嚴(yán)重。

本研究中，大分次照射組血清中TNF-α含量高于小分次照射組，在第5周時(shí)有顯著差異(P＜0.05);肺組織的急性炎癥大分次照射組亦較小分次照射組嚴(yán)重。到第24周時(shí)，兩組TNF-α含量已接近，并回落至正常水平，但大分次照射組大鼠肺組織出現(xiàn)明顯的纖維化，而小分次照射組肺組織損傷的非常輕微，接近正常大鼠肺組織。由此可見，在接受相同總劑量照射時(shí)，小分次照射組血清中TNF-α含量升高幅度低于大分次照射組，早期的放射性肺炎也明顯較大分次照射組輕。而對(duì)于后期纖維化則與TNF-α關(guān)系不大。

本研究結(jié)果顯示，照射總劑量相同而采用不同劑量分割模式照射，小分次照射組無論是早期的放射性肺炎還是晚期的纖維化都明顯較大分次劑量照射組輕，在后期幾乎沒有發(fā)生明顯的肺組織纖維化。可見在接受相同劑量照射條件下，小分次照射模式進(jìn)行照射更有利于肺組織等晚反應(yīng)組織的保護(hù)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)資料顯示，肺的分割照射α/β值為2.5～4.5 Gy，人類臨床資料推導(dǎo)人肺的α/β值為1.5～3.5 Gy，因而肺屬于晚反應(yīng)組織。晚反應(yīng)組織受到照射后主要通過亞致死性損傷的修復(fù)來抵御放射損傷，因此小分次照射對(duì)晚反應(yīng)組織有良好的保護(hù)作用。

［1］ Mehta V.Radiation pneumonitis and pulmonary fibrosis in nonsmall-cell lung cancer:pulmonary function，prediction，and prevention［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2005，63(1):5-24.

［2］ Franko A J，Sharplin J，Ghahary A，et al.Immunohistochemical localization of transforming growth factor beta and tumor necrosis factor alpha in the lungs of fibrosis-prone and"non-fibrosing"mice during the latent period and early phase after irradiation［J］.Radiat Res，1997，147(2):245-256.

［3］ De Jaeger K，Seppenwoolde Y，Kampinga H H，et al.Significance of plasma transforming growth factor-beta levels in radiotherapy for non-small-cell lung cancer［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2004，58(5):1378-1387.

［4］ 趙路軍，王綠化，王小震，等.血液中TGF-β、IL-6及ACE含量在預(yù)測放射性肺炎中的價(jià)值［J］.中華放射腫瘤學(xué)雜志，2006，15(3):217-221.

［5］ Kim J Y，Kim Y S，Kim Y K，et al.The TGF-β1 dynamics during radiation therapy and its correlation to symptomatic radiation pneumonitis in lung cancer patients［J］.Radiat Oncol，2009，4:59-64.

［6］ Rübe C E，Wilfert F，Palm J，et al.Irradiation induces a biphasic expression of pro-inflammatory cytokines in the lung［J］.Strahlenther Onkol，2004，180(7):442-448.

［7］ Zhang M，Qian J，Xing X，et al.Inhibition of the tumor necrosis factor-alpha pathway is radioprotective for the lung［J］.Clin Cancer Res，2008，14(6):1868-1876.