裴晉紅，柴文林，郭改娥，曹燕飛，汪軍梅，栗學清

(1.長治醫(yī)學院 生物化學教研室，山西 長治 046000;2.長治醫(yī)學院 附屬和濟醫(yī)院，山西 長治 046011)

p73是p53家族中第一個新成員，由Kaghad等于1997年首先發(fā)現(xiàn)，其染色體定位為1p36.2-3區(qū)。p73基因編碼的蛋白質(zhì)無論在結構上還是在功能上均與p53蛋白相似，且與腫瘤的發(fā)生密切相關。與p53基因不同的是，p73基因在人類大多數(shù)腫瘤中很少突變。目前許多資料表明，p73基因在許多腫瘤中均因異常甲基化而失活。本實驗旨在探討5-氮-2'-脫氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine)對非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin's lymphoma，NHL)p73基因甲基化的逆轉作用，從而為該疾病的治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑及儀器

Taq DNA聚合酶、λDNA HindⅢ Marker購自大連寶生物工程有限公司(TaKaRa);MMLV逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、無 RNA酶的 DNaseⅠ購自Roche公司;100 bp DNA ladder Marker購自MBI公司;一抗:p73兔抗人單抗、β-actin小鼠抗人單抗以及二抗:山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG均購自Santa Cruz公司。

DNA回收純化試劑盒(Wizard Clean-up System)購自Promega;DNA提取試劑盒購自Gentra公司。

所用引物均由廣州Invitrogen公司合成。

PCR儀，英國Tech gene公司;凝膠掃描成像系統(tǒng)，美國Syngene公司。

1.2 研究對象

24例NHL標本，年齡在22～58歲之間，平均年齡為40歲，其中男性15例，女性9例。12例反應性增生淋巴結樣本，年齡為15～48歲，平均年齡為31.5歲，其中男性8例，女性4例。以上樣本均采自湖南省腫瘤醫(yī)院。22例正常人外周血樣本，男性10例，女性12例，采自中南大學湘雅三醫(yī)院。

1.3 p73基因啟動子的甲基化分析

用液氮研磨淋巴結組織，提取DNA，亞硫酸氫鹽處理DNA后，再用甲基化特異性PCR(MSP)方法檢測p73基因外顯子1的甲基化狀況。甲基化產(chǎn)物的特異引物序列為:上游5'-GGA CGT AGC GAA ATC GGG GTT C-3';下游 5'-CGT CGC AAC CCC GAA CAT CG-3'。擴增片段大小67 bp。非甲基化產(chǎn)物的特異引物序列為:上游5'-AGG GGA TGT AGT GAA ATT GGG GTT T-3';下游 5'-CCA TCA CAA CCC CAA ACA TCA-3'，擴增片段大小 72 bp。PCR反應條件為:94℃變性2 min，94℃、30 s，60～55 ℃、30 s(每次循環(huán)降低 0.5℃)，72 ℃、30 s，10個循環(huán)，退火溫度55℃再循環(huán)30次，最后72℃延伸10 min。取 PCR產(chǎn)物10 μL，3%瓊脂糖凝膠電泳，電壓:120 V，時間:30 ～60 min，濃度為 0.5 μg/mL的EB染色，以100 bp DNA ladder為標準，凝膠成像系統(tǒng)掃描成像并分析結果。

1.4 原代細胞培養(yǎng)和5-氮-2'-脫氧胞苷處理后p73 mRNA表達情況檢測

將淋巴結組織在無菌條件下用含抗生素(500 u/mL青霉素和500 μg/mL鏈霉素)的Hank's液沖洗、剪碎，加細胞分離液分離細胞后進行原代細胞培養(yǎng)。將原代培養(yǎng)的NHL細胞以2×105個/mL的密度傳代，24 h后分別加入終濃度為0(對照)，4及8 μmol/L的5-氮-2'-脫氧胞苷進行處理。每隔24 h更換新的培養(yǎng)基，并重新加藥一次。連續(xù)處理3次，最后一次處理后24 h收集細胞，提取RNA，取RNA 2.0 μg反轉錄合成 cDNA，以 cDNA為模板進行PCR擴增。p73 mRNA引物序列:上游5'-GAC GGA ATT CAC CAC CAT CCT-3';下游5'-CCA GGC TCT CTT TCA GCT TCA-3'。擴增片段389 bp。PCR反應條件為:95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72℃、30 s，共循環(huán)35次;72℃延伸10 min。

取PCR產(chǎn)物5 μL，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，120 V，30～60 min，EB 染色，以100 bp DNA ladder為標準，凝膠成像系統(tǒng)掃描成像并分析結果。

1.5 統(tǒng)計學處理

NHL患者和對照組p73基因甲基化情況比較采用統(tǒng)計軟件程序SPSS10.0進行Chi-square test分析，P＜0.05時認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 甲基化結果

用MSP方法對24例NHL，反應性增生淋巴結及正常人外周血單個核細胞p73基因啟動子的甲基化進行檢測，取產(chǎn)物10 μL，3.0%瓊脂糖凝膠電泳(EB染色)，于凝膠掃描成像系統(tǒng)中觀察結果。24例NHL中21例發(fā)生甲基化，甲基化陽性率為87.5%，12例反應性增生淋巴結及22例正常人外周血淋巴細胞均未出現(xiàn)甲基化(見圖1～3)。用Chisquare test方法，對24例初診NHL的淋巴結組織、12例反應性增生淋巴結組織及22例正常人外周血單個核細胞p73基因的甲基化情況進行統(tǒng)計學分析，病例組和正常人比較，結果有顯著性差異(P＜0.01)，表明p73基因在NHL中甲基化頻率顯著增高。

圖1 NHL MSP產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 反應性增生MSP產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

圖3 正常人外周血單個核細胞MSP產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 5-氮-2'-脫氧胞苷處理后p73基因表達水平檢測結果

取部分p73基因陰性表達的NHL組織細胞進行原代培養(yǎng)，經(jīng)5-氮-2'-脫氧胞苷處理后，用 RTPCR檢測p73基因的表達，結果表明，p73基因恢復表達(見圖4)。

3 討論

p73是p53家族新成員，它和p53家族的其他成員一樣，處于相互聯(lián)系的信號網(wǎng)絡系統(tǒng)的中心位置，在正常生理活動和腫瘤的發(fā)生過程中調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化和細胞的死亡。p73基因的異常表達可引起腫瘤發(fā)生，它和人類許多腫瘤的發(fā)生密切相關，因此，p73是重要的腫瘤生物治療靶標。

圖4 5'-Aza-dc處理后非霍奇金淋巴瘤p73基因mRNA的表達

p73基因可產(chǎn)生多種蛋白質(zhì)異構體，這些蛋白質(zhì)異構體是由于啟動子不同或外顯子的不同拼接而產(chǎn)生，從功能上可分為 TAp73和△Np73兩大類［1-2］。TAp73是腫瘤抑制基因，由P1啟動子啟動而產(chǎn)生?！鱊p73是促癌基因，它是N-末端截斷了的p73轉錄本?，F(xiàn)在普遍認為，TAp73和△Np73的平衡調(diào)控細胞對于凋亡的敏感性［3］，當p73基因異常表達時腫瘤易于發(fā)生。

目前已有資料表明，基因CpG島的異常甲基化易導致人類多種疾病的發(fā)生和發(fā)展，特別在腫瘤的形成過程中起重要作用。據(jù)已有資料估算，有數(shù)百個基因因甲基化而沉默。如在胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)p16基因因啟動子區(qū)的高甲基化而沉默，并得出p16基因因啟動子區(qū)的異常甲基化可能是胃癌發(fā)病的機制之一［3］。p73基因由于P1啟動子的高甲基化而使p73基因表達下調(diào)，進而引起腫瘤發(fā)生。在急性白血病中p73基因的甲基化改變最為頻繁［4-6］。在急性淋巴細胞性白血病中，癌相關基因的甲基化是造成基因失活的最重要的方式［7］。在惡性淋巴瘤中p73基因由于甲基化而沉默［1］。NHL是惡性淋巴瘤的一大類型，在我國，惡性淋巴瘤中NHL所占的比例遠高于霍奇金病。很多國家NHL的發(fā)病率有一定增高趨勢，目前其發(fā)病原因尚不清楚。已有文獻報到，p73基因表達與p73基因啟動子的甲基化呈顯著負相關［8］;p73基因啟動子的甲基化可能是造成p73基因表達下調(diào)進而導致NHL發(fā)病的原因之一。

相對于DNA的突變，DNA甲基化可被DNA甲基化抑制劑作用而逆轉。DNA甲基化抑制劑5-氮-2'-脫氧胞苷是一種天然的脫氧胞苷酸的腺嘌呤核苷類似物，它通過抑制DNA甲基化轉移酶活性來恢復抑癌基因的功能，從而達到腫瘤治療的目的。有研究表明，5-氮-2'-脫氧胞苷對急性髓細胞性白血病、慢性髓細胞性白血病等具有重要的臨床治療意義。

NHL發(fā)病率高，在臨床治療過程中容易產(chǎn)生耐藥，目前仍然缺乏有效的治療手段和治療藥物。本實驗用MSP方法對24例NHL p73基因啟動子的甲基化進行檢測，用5-氮-2'-脫氧胞苷處理部分NHL原代培養(yǎng)細胞后，檢測p73mRNA表達情況。結果表明p73基因啟動子的甲基化可被5-氮-2'-脫氧胞苷逆轉，導致因甲基化而被抑制的p73基因表達上調(diào)。

總之，啟動子區(qū)高甲基化引起的抑癌基因失活為腫瘤研究領域帶來了新的發(fā)現(xiàn)，也為腫瘤的診斷、治療及預后帶來了新的思路。去甲基化試劑5-氮-2'-脫氧胞苷在臨床上已有應用［9］。盡管目前在臨床治療過程中還存在一些問題，但去甲基化藥物的應用有望將腫瘤的治療帶入一個新的領域。

(此課題在中南大學完成)

［1］ Pluta A，Nyman U，Joseph B，et al.The role of p73 in hematologica malignancies［J］.Leukemia，2006，20:757-766.

［2］ Marabese M，Vikhanskaya F，Beoggini M.p73:A chiaroscuro gene in cancer［J］.Eur J Cancer，2007，43:1361-1372.

［3］ Luo D Y.Methylation of CpG of p16 associated with progression of primary gastric［J］.Lab Invest，2006，86:591-598.

［4］ Garcia-Manero G，Daniel J，Smith T L，et al.DNA methylation of multiple promoter-associated CpG islands in adult acute lymphocytic leukemia［J］.Clin Cancer Res，2002，8:2217-2224.

［5］ Roman-Gomez J，Jimenez-Velasco A，Castillejo J A，et al.Promoter hypermethylation of cancer-related genes:A strong independent prognostic factor in acute lymphoblastic leukemia［J］.Blood，2004，104:2492-2498.

［6］ Garcia-Manero G，Yang H，Kuang S Q.Epigenetics of acute lymphocytic leukemia［J］.Semin Hematol，2009，46:24-32.

［7］ Roman-Gomez J，Jimenez-Velasco A，Barrios M.Poor prognosis in acute lymphoblastic leukemia may relate to promoter hypermethylation of cancer-related genes［J］.Leuk Lymphoma，2007，48:1269-1282.

［8］ Kawano S，Miller C W，Gombart A F et al.Loss of p73 gene expression in leukemias/lymphomas due to hypermethylation［J］.Blood，1999，94(3):1113-1120.

［9］ Chowdhury S，Seropian S，Marks P W.Decitabine combined with fractionated gemtuzumab ozogamicin therapy in patients with relapsed or refractory acute myeloid leukemia［J］.Am J Hematol，2009，84(9):599-600.