劉 琳，謝志明

(遼寧醫(yī)學(xué)院 附屬第三醫(yī)院 腎內(nèi)科，遼寧 錦州 121000)

血管生成素(Angiopoietins，Ang)是一組內(nèi)皮細(xì)胞特異性分泌型生長因子，1985年，Ang首次從人結(jié)腸癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中被發(fā)現(xiàn)［1］，Ang的四種同分異構(gòu)體之一的Ang-1與血管的形成密切相關(guān)［2］，且具有抑制內(nèi)皮凋亡、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞出芽、穩(wěn)定血管及降低血管通透性的作用［3］。近年來，其在小鼠腎臟胚胎血管發(fā)育以及人的腎臟功能調(diào)控方面的作用日益受到關(guān)注，但對小鼠腎臟發(fā)育中表達(dá)變化規(guī)律的研究目前國內(nèi)報道較少。

本文觀察了Ang-1在小鼠腎臟發(fā)育中的形態(tài)學(xué)變化，并應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)及免疫印跡技術(shù)(Western blotting)對其進(jìn)行了定性及定量觀察，以探討在小鼠腎臟發(fā)育中Ang-1的作用。

1 材料

Ang-1兔抗小鼠多克隆抗體、SABC試劑盒，武漢博士得生物制品公司。

Zeiss-A1顯微鏡和照相機(jī)(德國);MIVNT顯微圖像分析系統(tǒng)(中國)。

昆明系小鼠，遼寧醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，許可證號:SCXK(遼)2003-2007。

2 方法

2.1 實驗動物培養(yǎng)及取材

昆明系小鼠，以觀察到陰道栓脫落的最早時間計為胚齡0 d。記錄受孕時間。隨后每日早8點和晚5點觀察仔鼠出生情況，記錄出生時間。取胚齡14，16，18 d 胎鼠和出生后 1，7，14，21 和 42 d 仔鼠，每組4只，每只母鼠取2只胎鼠或仔鼠。分別取胎鼠及仔鼠的左右腎臟。左腎放入10%中性福爾馬林溶液固定，右腎入液氮迅速冷凍，-80℃冰箱保存，留做Western blotting試驗。

2.2 光鏡標(biāo)本制備

左腎經(jīng)固定、沖洗、脫水，石蠟定向包埋，切片厚5 μm，部分切片HE染色，部分切片用于免疫組化染色，光鏡下觀察。

2.3 免疫組化檢測Ang-1的表達(dá)

切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2室溫10 min，0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)中修復(fù)10 min，山羊血清封閉液 20 min(室溫)，滴加 Ang-1一抗(1∶100)4℃過夜，加 SABC試劑孵育30 min，DAB顯色8 min。蘇木素復(fù)染，經(jīng)脫水、透明、封片。

2.4 Ang-1組化表達(dá)強度的測定

圖像用CISA-1000型細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)處理，每個動物腎臟隨機(jī)選取7張切片，且每張切片隨機(jī)選取7個陽性表達(dá)區(qū)域。以切片背景色為參照，灰度值越高，表明Ang-1含量越低。

2.5 Western blotting檢測Ang-1的蛋白表達(dá)

取冷凍待用的右腎組織，加入4倍體積的細(xì)胞裂解液，0℃下剪碎、勻漿，靜置30 min，4℃，12 000 r/min離心10 min，用Bradford法測定蛋白含量。配制10%的分離膠和5%的濃縮膠，取上述制備的樣品，加到濃縮膠的樣品孔，80 V電壓下電泳，待指示劑達(dá)到分離膠時，將電壓增加至120 V，常溫下轉(zhuǎn)印，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗(稀釋度為1∶500)4℃過夜，BCIP/NBT試劑顯色，經(jīng)掃描電泳條帶，獲得結(jié)果，用Gene Tool軟件分析電泳條帶光密度。

2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果

發(fā)育中腎小體可分5期:Ⅰ期為逗號小體;Ⅱ期為S小體;Ⅲ期為毛細(xì)血管袢期;Ⅳ期又稱未成熟期;Ⅴ期即成熟腎小體。光學(xué)顯微鏡下觀察到，胚齡14 d，腎臟已形成完整的被膜，且于腎被膜下可見大量早期腎小體，這部分皮質(zhì)稱為生腎區(qū)。胚齡16 d，腎臟皮質(zhì)和髓質(zhì)清晰可見，此時大部分腎小體仍為逗號小體和S小體，偶見Ⅳ和Ⅴ期腎小體，可見少量近直小管、遠(yuǎn)直小管和集合管構(gòu)成，其間大量腎間質(zhì)。胚齡18 d，髓放線出現(xiàn)。生后1 d，Ⅳ和Ⅴ期腎小體數(shù)量明顯增加。生后7 d，只可見Ⅴ期腎小體。出生14 d后，腎臟體積增大，腎小體的體積也隨之增大，大量成熟腎小體、腎小管出現(xiàn)。

3.2 免疫組化染色結(jié)果

3.2.1 Ang-1免疫組化染色結(jié)果 Ang-1在胚齡14 d的胎鼠腎臟開始出現(xiàn)表達(dá)，但表達(dá)微弱，部位在腎間質(zhì)細(xì)胞。以后隨著胚(日)齡的增加，表達(dá)逐漸增多且分布廣泛，主要分布在腎小體、腎小管、腎間質(zhì)以及腎血管中，生后14 d表達(dá)最為顯著，以后表達(dá)逐漸減弱。

3.2.2 Ang-1免疫組化表達(dá)強度的測定 Ang-1在小鼠腎臟發(fā)育的不同時期均呈不同程度的表達(dá)，胚齡14，16 和18，生后1，7，14，21 和42 d 其灰度值依次為150.36±6.53，134.22±5.23，112.46±5.56，100.61 ±4.09，85.43 ±4.14，68.59 ±5.07，92.31 ±6.64和160.31±4.12，各時間灰度值和前一時間的灰度值比較，均有顯著差異(P＜0.05)。見圖1。

圖1 小鼠腎臟發(fā)育不同時期Ang-1的灰度變化Fig.1 Gray of Ang-1 in different periods of mice kidney development

3.3 Western blotting結(jié)果

Ang-1和β-actin的分子質(zhì)量分別為100和42 kb，以β-actin的吸光度值作為內(nèi)參照，經(jīng)校正，再進(jìn)行半定量分析。結(jié)果隨著時間的增加，Ang-1的蛋白含量增多，在生后21 d含量達(dá)到最高水平，此后開始逐漸下降。見圖2。

圖2 小鼠腎組織中Ang-1蛋白含量變化Fig.2 Ang-1 protein content changes in mice in renal tissue

4 討論

Ang有四種同分異構(gòu)體，即 Ang-1、Ang-2、Ang-3、Ang-4。其中Ang-1與胚胎血管的生成以及成熟血管的構(gòu)建與維持關(guān)系密切。以往實驗發(fā)現(xiàn)，通過轉(zhuǎn)基因方法使Ang-1或受體基因失活時，轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎則不能正常發(fā)育，而死于血管網(wǎng)絡(luò)形成后的血管成形缺陷［4］。在Ang-1無義突變的小鼠胚胎中，血管內(nèi)皮細(xì)胞聚集成團(tuán)，并且與管周細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)連接異常，提示Ang-1具有維持血管穩(wěn)定性的作用［5］。此外，Ang-1還能夠通過下調(diào)E-選擇素基因表達(dá)，起到保持血管內(nèi)皮層穩(wěn)定的作用，降低了血管通透性［6］。我們應(yīng)用免疫組化和Western blotting方法檢測Ang-1在小鼠腎臟的表達(dá)，結(jié)果表明，Ang-1在胚齡14 d的胎鼠腎臟中開始出現(xiàn)表達(dá)，但表達(dá)微弱，部位在腎間質(zhì)細(xì)胞。以后隨著胚(日)齡的增加，表達(dá)逐漸增多且分布廣泛，主要分布在腎小體、腎小管、腎間質(zhì)以及腎血管中。研究表明，Ang-1對血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)有強大的調(diào)節(jié)作用，它對VEC有明顯的趨化作用，可以介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞趨化和遷移［7］。在Ang-1的作用下，VEC在遷移的同時可以出芽，這也是血管生成的基礎(chǔ)［8］。而腎小球內(nèi)皮細(xì)胞正是腎小體濾過屏障的重要組成部分。研究還發(fā)現(xiàn)，Ang-1可以抑制腎小體發(fā)育過程中內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象［9］，所以隨著小鼠胚(日)齡的增加以及腎小體的發(fā)育，Ang-1的表達(dá)也逐漸增多，主要作用是介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的生存，拮抗內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，并調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞之間及其細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞形成腎小體血管結(jié)構(gòu)，并且維持著成熟血管的穩(wěn)定性。Ang-1同時也表達(dá)在腎小管。在腎臟發(fā)育過程中，大部分腎小管都有Ang-1mRNA表達(dá)，表明Ang-1的表達(dá)對腎間質(zhì)血管的發(fā)育至關(guān)重要［10］。

哺乳動物的腎臟起源于輸尿管芽及其誘導(dǎo)的生后腎組織。輸尿管芽分化、發(fā)育為各級集合管，生后腎組織將發(fā)育為生腎區(qū)，并經(jīng)過細(xì)胞集聚，發(fā)育為腎單位。我們觀察到生后7 d生腎區(qū)消失，此時不再有新的腎單位產(chǎn)生，腎小體數(shù)目恒定，不再增加，而以單個腎小體體積增大為主。從血管球和腎小囊的比例來看，腎小囊所占的比例逐漸減少，而血管球所占的比例逐漸上升［11］。生后14 d，是腎臟的生長和成熟最明顯的時期，此時Ang-1的水平最高。故可以推測Ang-1具有促進(jìn)血管成熟、改建以及塑型的作用，尤其在維持血管的穩(wěn)定性方面作用尤為顯著。在成熟腎臟中，仍可見Ang-1在腎小體和間質(zhì)血管的表達(dá)，說明血管成熟后，Ang-1仍然起著維持血管的完整性和穩(wěn)定性的作用。因此，在腎臟發(fā)育的不同時期，Ang-1在腎臟表達(dá)部位及強度的不同，顯示了Ang-1在腎臟發(fā)育過程中，參與了腎單位的形成和促進(jìn)其成熟的作用，并調(diào)控和維持著正常腎小球濾過功能以及腎小管的回吸收功能。

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