陳斗仁，杜莉婷

(1.江蘇省淮安市第二人民醫(yī)院 制劑室，2.南京醫(yī)藥天頤分公司，江蘇 淮安 223002)

冠狀動(dòng)脈發(fā)生粥樣硬化病變過(guò)程中，硬化斑塊發(fā)生破裂、膠原暴露、血小板激活發(fā)生黏附聚集、引起血栓形成［1］，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈血管發(fā)生閉塞性或者非閉塞性血栓形成，因此抗凝和抗血小板治療非常重要［2］。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)單獨(dú)使用氯吡格雷或氯吡格雷聯(lián)合其他抗血小板藥物抑制動(dòng)脈粥樣硬化做了很多研究，但氯吡格雷聯(lián)合肝素對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響鮮有報(bào)道。本文研究了抗血小板藥物氯吡格雷聯(lián)合抗凝藥肝素對(duì)實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化的影響。

1 材料

氯吡格雷，武漢大華偉業(yè)醫(yī)藥化工集團(tuán);肝素，黃山市屯溪區(qū)誠(chéng)義生物再生制品廠;膽固醇，上海晶純實(shí)業(yè)有限公司;膽酸鈉，上海晶純實(shí)業(yè)有限公司;丙基硫氧嘧啶，湖北健源化工有限公司;維生素D3注射液，江蘇吳中醫(yī)藥集團(tuán)有限公司。

血脂測(cè)定試劑盒，北京市斑珀斯技貿(mào)有限責(zé)任公司;血清C反應(yīng)蛋白(CRP)測(cè)定試劑盒，Sigma公司;巨噬細(xì)胞單克隆抗體RAM11，Denmark公司;大鼠平滑肌肌動(dòng)蛋白單克隆抗體1A4，Sigma公司;免疫組織化學(xué)Power VisionTM-PV6002試劑盒，PowerVision。

雄性SD大鼠，體質(zhì)量250 g，南京軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(軍)2007-004。

2 方法

2.1 模型建立與分組給藥

SD大鼠，隨機(jī)分為5組:正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、肝素組、氯吡格雷組、氯吡格雷與肝素合用組，每組15只。正常對(duì)照組給予正常飼料喂食80 d，其余4組給予高脂飼料(3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%豬油、81.3%基礎(chǔ)飼料)喂食80 d，同時(shí)在給予飼料前，腹腔注射維生素D3注射液60萬(wàn)單位/kg。對(duì)照組給予同體積的生理鹽水。每周記錄體質(zhì)量［3］。另外，肝素組灌胃給予肝素10 mg/(kg·d)、氯吡格雷組灌胃給予氯吡格雷3 mg/(kg·d)、氯吡格雷與肝素合用組灌胃給予肝素10 mg/(kg·d)和氯吡格雷3 mg/(kg·d)。

2.2 血脂和CRP含量測(cè)定

血清中血脂含量測(cè)定采用酶聯(lián)免疫法，指標(biāo)包括總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)。在第80天，取靜脈血利用固相酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)血清CRP含量。

2.3 病理學(xué)觀察

在80 d后，處死大鼠，摘取主動(dòng)脈5 mm，并取肝臟橫斷面，用10%福爾馬林固定，HE染色后觀察主動(dòng)脈壁斑塊沉積情況。

2.4 免疫組織化分析

采用免疫組化SP法，按試劑盒說(shuō)明操作，以藥盒提供的陽(yáng)性片為陽(yáng)性對(duì)照，用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗為陰性對(duì)照。采用顯微-電腦圖像分析系統(tǒng)計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。組間比較用卡方檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 血脂含量與體重

80 d后，各組大鼠的體質(zhì)量比試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)顯著增加(P＜0.05)，但各組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);4組高膽固醇飼料組動(dòng)物的血清中TC、LDLC、TG水平均顯著升高(P＜0.05)，且明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.05)，說(shuō)明動(dòng)脈粥樣硬化大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒊晒?。肝素組與模型對(duì)照組相比，TC、TG水平顯著降低(P＜0.05)，氯吡格雷組與模型對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，合用組血脂水平與模型對(duì)照組相比，TC、TG水平顯著降低(P＜0.05)。肝素組、合用組與模型對(duì)照組相比，HDL-C水平有 上升趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血脂含量的比較(n=15，±s)

表1 各組大鼠血脂含量的比較(n=15，±s)

與0時(shí)比較:1P＜0.05;與正常對(duì)照組比較:2P＜0.05;與模型組比較:3P＜0.05

組 別 時(shí)間/d 體質(zhì)量/kg TC/(mmol/L) TG/(mmol/L) HDL-C/(mmol/L)LDL-C/(mmol/L)正常對(duì)照組 0 0.25±0.06 0.79±0.29 1.82±0.55 0.79±0.15 0.95±0.64 80 0.55±0.051 0.82±0.411 1.94±0.821 0.78±0.21 0.85±0.821模型對(duì)照組 0 0.25±0.10 0.80±0.43 1.79±0.35 0.82±0.18 1.23±0.29 80 0.59 ± 0.041 2.25 ± 0.441，2 55.45 ± 8.651，2 0.70 ± 0.15 51.84 ± 8.331，2肝素組 0 0.25±0.06 0.81±0.34 1.81±0.23 0.81±0.14 0.95±0.51 80 0.43 ± 0.211 1.34 ± 0.801，2，3 32.89 ± 5.541，2，3 0.77 ± 0.15 40.19 ± 5.261，2，3氯吡格雷組 0 0.26±0.06 0.79±0.25 1.81±0.54 0.74±0.23 0.97±0.48 80 0.58 ± 0.131 1.64 ± 0.131，2 38.9 ± 12.121，2 0.70 ± 0.14 47.60 ± 11.961，2合用組 0 0.26±0.06 0.84±0.11 1.80±0.54 0.79±0.16 1.30±0.47 80 0.42 ± 0.121 1.20 ± 0.981，2，3 31.82 ± 8.891，2，3 0.78 ± 0.13 37.05 ± 8.601，2

3.2 CRP含量

肝素組、氯吡格雷及合用組中血清CRP濃度分別為177，189和141 μg/L，均高于正常對(duì)照組(80 μg/L)(P ＜0.05)，但明顯比模型對(duì)照(267 μg/L)組低(P＜0.05)。肝素組和氯吡格雷組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。合用組與肝素組、氯吡格雷組相比雖然無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，但有進(jìn)一步降低的趨勢(shì)。

3.3 主動(dòng)脈及免疫組織學(xué)變化

正常對(duì)照組組主動(dòng)脈內(nèi)膜平整光滑，而模型對(duì)照組主動(dòng)脈管腔直徑變小，內(nèi)膜明顯變厚，內(nèi)膜表皮大量平滑肌細(xì)胞增生，脂質(zhì)斑塊彌漫，可見(jiàn)泡沫細(xì)胞積聚，斑塊底部泡沫細(xì)胞發(fā)生變性壞死，內(nèi)彈力層與中彈力板發(fā)生變性、斷裂和崩解，在內(nèi)膜和中膜均出現(xiàn)了大量的斑塊和炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肝素組、氯吡格雷組及合用組的病變程度相對(duì)模型對(duì)照組有所減輕。藥物干預(yù)組的斑塊內(nèi)膜面積比、內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜中膜厚度比與模型對(duì)照組相比顯著降低(P＜0.05)，且合用組的斑塊內(nèi)膜面積比、內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜中膜厚度比與肝素組、氯吡格雷組相比明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的主要組成細(xì)胞是巨噬細(xì)胞。肝素組、氯吡格雷組及合用組中巨噬細(xì)胞含量與模型對(duì)照組相比，明顯減少(P＜0.05)。合用組組與肝素組、氯吡格雷組相比有顯著差異(P＜0.05)，肝素組與氯吡格雷組之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見(jiàn)表2。

表2 氯吡格雷、肝素及合用對(duì)大鼠主動(dòng)脈組織的影響(n=15，±s)

表2 氯吡格雷、肝素及合用對(duì)大鼠主動(dòng)脈組織的影響(n=15，±s)

與模型對(duì)照組比較:1P＜0.05;與肝素組比較:2P＜0.05;與氯吡格雷組比較:3P＜0.05

組別 斑塊、內(nèi)膜面積比/% 內(nèi)膜厚度/μm 內(nèi)膜中膜厚度比/% 巨噬細(xì)胞/%模型對(duì)照組 93.33±10.11 142.67±1.22 51.15±11.23 57.90±1.22肝素組 67.09±9.541 86.67±3.451 29.82±3.231 41.00±3.451氯吡格雷組 67.65±5.451 64.89±4.541 24.69±5.481 40.93±4.541合用組 31.64 ± 3.211，2，3 34.22 ± 2.321，2，3 13.85 ± 0.651，2，3 24.33 ± 2.321，2，3

4 討論

本研究采用喂食高膽固醇飼料誘導(dǎo)大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型，研究肝素與氯吡格雷及兩藥聯(lián)合使用對(duì)大鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變的作用。結(jié)果顯示，肝素能明顯降低血清中TC、TG的水平，而氯吡格雷對(duì)血脂水平影響不大，但兩藥合用能明顯降低降低血清中TC、TG的水平。這可以說(shuō)明氯吡格雷抑制動(dòng)脈粥樣硬化與血脂水平無(wú)關(guān)，肝素抑制動(dòng)脈粥樣硬化與血脂水平有關(guān)。本研究還顯示，肝素與氯吡格雷可使血清CRP濃度降低，且聯(lián)合用藥有進(jìn)一步降低的趨勢(shì)。氯吡格雷與肝素減小斑塊面積、抑制內(nèi)膜增生的作用相當(dāng)，兩藥聯(lián)合使用后作用顯著增強(qiáng)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，肝素、氯吡格雷及兩藥合用均使斑塊中巨噬細(xì)胞數(shù)減少，提示抗血小板藥物可能通過(guò)抑制巨噬細(xì)胞的遷移和增殖，減輕了動(dòng)脈局部炎癥反應(yīng)。

肝素促使釋放的脂酶，可降解乳糜微粒中的TG，同時(shí)使載體蛋白和游離膽固醉轉(zhuǎn)變成高密度脂蛋白，高密度脂蛋白能防止膽固醇在末梢組織沉積并對(duì)低密度所致的血管內(nèi)皮損傷有抑制作用，同時(shí)肝素能夠加強(qiáng)抗凝血酶Ⅲ對(duì)凝血因子Ⅹa的滅活，從而影響凝血過(guò)程［4］，再者低分子肝素有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞作用。所以肝素能抑制動(dòng)脈粥樣硬化。應(yīng)用氯吡格雷聯(lián)合肝素抑制動(dòng)脈粥樣硬化，優(yōu)于單獨(dú)使用氯吡格雷。

［1］ Huo Y Q，Schober A，F(xiàn)orlow S B，et al.Circulating activated platelets exacerbate atherosclerosis in mice deficient in apolipoprotein E［J］.Nat Med，2003，9(1):61-67.

［2］ Corsetti J P，Rainwater D L，Moss A J，et a1.High lipoprotein-associated phospholipase A2 is a risk factor for recurrent coronary.E-vents in postinfarction patients［J］.Clin Chem，2006，52(7):1331-1338.

［3］ 周永剛，藍(lán)曉紅.動(dòng)脈粥樣硬化大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⑴c評(píng)價(jià)［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)學(xué)報(bào)，2011，27(5):399-401.

［4］ 劉軍妮，徐冬玲.血清脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的相關(guān)研究［J］.2009，40(1):18-21.