張 利，趙 軍，趙釤妤

(1.云南省食品藥品檢驗所，云南 昆明 650011;2.云南永安制藥有限公司，云南 曲靖 655000;3.云南大理學(xué)院 藥學(xué)院，云南 大理 671000)

龍心素膠囊為鮮地龍經(jīng)適宜方法加工制成的膠囊劑，其功能主治為活血通絡(luò)，用于淤血阻絡(luò)所致的缺血性中風(fēng)，癥見半身不遂，肢體麻木，口眼歪斜［1］。龍心素膠囊的主要活性成分為鮮地龍中的水解蛋白酶——蚓激酶［2］，它能夠明顯改善神經(jīng)功能缺損程度及血液流變學(xué)各項指標(biāo)，在治療心腦血管疾病方面療效確切［3］。目前，蚓激酶活性測定主要有對甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯(TAME)法［4］，光散射法［5］，TPA-纖維蛋白平板法［6］及瓊脂糖纖維蛋白平板法［7］。龍心素膠囊原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［1］活性測定采用瓊脂糖纖維蛋白平板法，以溶圈面積表示樣品的活性單位，測定誤差偏大，且用面積表示效價很難與其他含蚓激酶產(chǎn)品的效價相比較?？紤]到瓊脂糖纖維蛋白平板法簡便易行，本研究對龍心素膠囊的活性測定方法進行了改進，并改進原標(biāo)準(zhǔn)的鑒別方法，對樣品的重金屬與砷鹽進行檢查。

1 儀器與試藥

游標(biāo)卡尺(上海量具刃具廠);超聲儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。

龍心素膠囊 10批(批號:100901，100902，100701，110101，110102，101101，101102，101103，101104，101105)，云南永安制藥有限公司;牛纖維蛋白原(批號:200736，200232)、牛凝血酶(批號:605-0123，605-9822，622-9906)、蚓激酶標(biāo)準(zhǔn)品(批號:200301，200502)，中國藥品生物制品檢定所;瓊脂糖(批號:100107)，上海伯奧生物科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 鑒別

(1)取瓊脂糖纖維蛋白平板一個，吸取生理鹽水和2.3.2.2項下供試品各10 μL，分別點于板上，在37℃恒溫培養(yǎng)18 h。供試品有明顯溶圈，生理鹽水無明顯溶圈。

(2)取本品內(nèi)容物0.1 g，加生理鹽水2 mL，振搖5 min，離心，取上清液1 mL，加入20%三氯乙酸溶液0.5 mL，溶液變渾濁。

結(jié)果表明，10批樣品鑒別均呈正反應(yīng)。

2.2 檢查

照《中國藥典》(2010版，二部)的方法進行重金屬與砷鹽檢查，結(jié)果表明，10批樣品重金屬含量未過百萬分之二十，砷鹽含量未過百萬分之二。

2.3 活性測定

2.3.1 影響因素考察

2.3.1.1 溶劑 取相同重量的供試品兩份(批號:100903)，分別用原標(biāo)準(zhǔn)的硼砂緩沖液(pH 7.8)及生理鹽水溶解供試品，各點8個點，結(jié)果顯示同一濃度的供試液溶圈平均直徑分別為2.265與2.242 cm，說明溶劑對結(jié)果的影響較小，考慮方便易行，故選用生理鹽水為溶劑。

2.3.1.2 瓊脂糖與纖維蛋白原 據(jù)報道［7］，瓊脂糖纖維蛋白平板法測定蚓激酶效價，溶圈面積不易受不同批次的瓊脂糖及纖維蛋白原的影響。

分別用0.05%，0.3%和0.5%的瓊脂糖制成不同的纖維蛋白平板進行試驗，結(jié)果表明，瓊脂濃度越大，溶圈面積越小。以0.05%瓊脂糖試驗其溶圈面積大且不規(guī)則，易變形，0.5%的瓊脂溶液制成的纖維蛋白平板得到的溶圈形狀較規(guī)則，大小適中，不易因抖動而變形。

2.3.1.3 提取時間 采用不同超聲提取時間考察對同一批樣品(批號100903)的蚓激酶的提取效果，結(jié)果超聲10與30 min效果一致，故選擇10 min。

2.3.1.4 培養(yǎng)時間 同一供試品(批號100903)的溶液分別恒溫培養(yǎng)15，18和21 h后測定溶圈面積，結(jié)果18 h時的面積比15 h時的面積有所擴大，而18 h與21 h的面積基本相同，所以選擇18 h。

2.3.1.5 纖維蛋白平板放置時間 原標(biāo)準(zhǔn)要求放置1 h，根據(jù)試驗結(jié)果放置0.5與1 h結(jié)果一致。

2.3.2 測定方法

2.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 取蚓激酶標(biāo)準(zhǔn)品，按標(biāo)示效價用生理鹽水分別稀釋成每1 mL含12 500與25 000 U的2種濃度的溶液(S1、S2)。

2.3.2.2 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物適量，按估計效價照標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備法制成2種同樣的濃度梯度的溶液(T1、T2)，供試品和標(biāo)準(zhǔn)品高低劑量所致的反應(yīng)均值應(yīng)相近，超聲提取10 min，離心，取上清液作為供試品溶液。

2.3.2.3 0.5%瓊脂糖溶液的制備 取瓊脂糖0.5 g，加入硼砂緩沖液(pH 7.8)100 mL，加熱煮沸，置60℃水浴中平衡，備用。

2.3.2.4 纖維蛋白原溶液的制備 取牛纖維蛋白原適量，用硼砂緩沖液(pH 7.8)制成每1 mL含可凝結(jié)蛋白2 mg的溶液。

2.3.2.5 凝血酶溶液的制備 取牛凝血酶用硼砂緩沖液(pH 7.8)制成每1 mL含40 BP單位的溶液，即得。

2.3.2.6 纖維蛋白平板的制備 取已消毒的培養(yǎng)皿(直徑90 mm)，吸取纖維蛋白原溶液8 mL于平皿中，快速吸取0.5%瓊脂糖溶液2 mL和凝血酶溶液0.5 mL加入培養(yǎng)皿中，充分混勻，水平放置0.5 h。

2.3.2.7 測定法 取纖維蛋白平板不少于4只，取不同標(biāo)準(zhǔn)品溶液及供試品溶液各10 μL，分別點于同一平板(高低劑量呈對角點樣)，加蓋，置37℃培養(yǎng)18 h，取出，溶纖后形成的斑點用0.25%番紅花染色液染色，分別用游標(biāo)卡尺測定斑點垂直兩直徑(長短徑)，以平均直徑計算面積，將溶圈面積換算成對數(shù)，照生物檢定統(tǒng)計法中量反應(yīng)平行線(2.2)法計算蚓激酶的效價，可信限率(FL%)不得大于20%。

2.3.3 方法學(xué)研究

2.3.3.1 線性 取蚓激酶標(biāo)準(zhǔn)品加生理鹽水分別制成每 1 mL 含蚓激酶 33 000，26 400，19 800，9 900，8 250 U 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取10 μL點樣，測定溶圈面積，以濃度為橫坐標(biāo)(X)，溶圈面積為縱坐標(biāo)(Y)，進行線性回歸，得回歸方程:Y=0.804 3 X+1.426 9，r=0.998 6。表明蚓激酶在8 250～33 000 U/mL范圍內(nèi)與溶圈面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3.2 專屬性 以處方比例按2.3.2.2項下方法制成不含鮮地龍的陰性對照溶液，將與樣品含量一致的標(biāo)準(zhǔn)品添加至陰性對照溶液中，制備空白回收樣品。按活性測定方法測定，結(jié)果顯色劑未發(fā)生擴散，即在陰性對照樣品處未出現(xiàn)溶圈，而空白回收樣品處溶圈與樣品一致，證明陰性對照無干擾。

2.3.3.3 精密度 取同一濃度的供試液(批號:100903)，取5個培養(yǎng)皿，在每個培養(yǎng)皿上點4個點，測定每個點的溶圈面積，結(jié)果RSD為4.71%。

2.3.3.4 重復(fù)性 取供試品(批號:100903)6份，測定蚓激酶效價，結(jié)果RSD為6.54%。

2.3.3.5 穩(wěn)定性試驗 取儲存于4℃下同一供試品溶液，分別在0，24，48和72 h點樣，測定其溶圈面積，結(jié)果表明，供試品溶液在4℃下72 h穩(wěn)定。

2.3.3.6 回收率試驗 取已知含量樣品(批號:100703，效價810.7 U/mg)，取9份(每份約0.31 g)，分別精密稱定，再精密稱取蚓激酶原料(批號:100701，效價8 760.3 U/mg)9份(相當(dāng)于含量的120%，100%和80%，各3份)，分別加入樣品中，按效價測定方法測定，結(jié)果見表1，平均回收率為94.63%，RSD為7.69%。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests

2.3.4 樣品測定 對10批樣品進行效價測定，用量反應(yīng)平行線(2.2)法計算效價，結(jié)果見表2。根據(jù)10批樣品的效價測定可信限率實驗結(jié)果，對誤差的控制要求為本法的可信限率FL(%)在20%內(nèi)。效價平均值為788.1 U/mg，考慮到原料來源及測定誤差等因素，按平均值下移20%作為限度，規(guī)定每1 mg供試品蚓激酶效價應(yīng)不少于630 U。

3 討論

表2 10批樣品的活性測定Tab.2 The activity determination of 10 batches of sample

原標(biāo)準(zhǔn)的兩項鑒別均為酶的化學(xué)反應(yīng)方法，專屬性不強，本研究采用蚓激酶活性測定法代替其中的第1項鑒別，使之能反應(yīng)出蚓激酶的活性特征。

本研究考查了10批樣品的重金屬及砷鹽含量，結(jié)果均未過規(guī)定，故重金屬及砷鹽檢查可不列入標(biāo)準(zhǔn)。

本研究確定改用0.5%瓊脂糖制纖維蛋白平板、用生理鹽水提取并超聲10 min等條件，使得到的溶圈形狀規(guī)則，結(jié)果更準(zhǔn)確，操作更簡便、快速。

原標(biāo)準(zhǔn)僅以溶圈面積表示樣品的活性單位，其結(jié)果易受實驗條件及人為因素的影響，誤差較大。本法引入蚓激酶標(biāo)準(zhǔn)品，減少了外界因素的影響，采用操作簡單、方便的量反應(yīng)平行線(2.2)法計算效價，研究結(jié)果及對可信限率(FL%)的控制要求與文獻［7］采用的量反應(yīng)平行線(3.3)法基本一致。另外因效價測定時所需測量的溶圈透明，邊緣難確定，易造成人為誤差，本研究采用染色劑對溶圈進行染色，使溶圈邊緣更直觀，易于測量，減小了誤差。

［1］ WS-10005(ZD-0005)-2004，國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)(試行)，龍心素膠囊［S］.

［2］ 周 海，王春維，張 怡，等.蚓激酶的提取純化及性質(zhì)研究［J］.中國生化藥物雜志，2011，32(3):212-216.

［3］ 滕文姣，孫晉民.蚓激酶的藥學(xué)與臨床研究進展［J］.西北藥學(xué)雜志，2011，26(1):69-70.

［4］ 李劍梅，苗玉琨，李 鑫.TAME法對康脂口服液中蚓激酶單位效價的測定［J］.微生物學(xué)雜志，2004，21(3):61.

［5］ 周 靚，姜 葵，赫榮喬.光散射法測凝血酶、水蛭素及蚓激酶活性［J］.生物物理學(xué)報，1997，13(4):531.

［6］ 李 群，周淑平，紀(jì) 宏，等.蚓激酶及其制劑活性測定的研究［J］.中國藥事，1998，12(5):286-287，289.

［7］ 董培智，樸晉華，黨愛華，等.量反應(yīng)平行線法在溶栓膠囊蚓激酶效價測定方法學(xué)研究中的應(yīng)用［J］.中國中藥雜志，2010，35(11):1410-1414.