李 曉，徐承水，趙云峰

(1.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 濟(jì)寧 272013;2.曲阜師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 曲阜 273165)

海帶(Laminaria japonica Aresch)是褐藻門(Phaeophyta)的一種大型海藻，它作為一種重要的海生資源，其食用與藥用價(jià)值很早就為世人所知?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)從海帶中提取的海帶硫酸多糖(Laminaria polysaccharide sulphate，LPS)是一種特有的含有硫酸酯的天然活性多糖，具有抗凝血、抗腫瘤、抗病毒、抗血栓、提高免疫力等活性［1-4］，并且細(xì)胞毒性試驗(yàn)表明，LPS對(duì)機(jī)體沒(méi)有毒副作用［5］。為了闡明海帶LPS的作用機(jī)制，并對(duì)其進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)和利用，我們對(duì)LPS的體外抗腫瘤活性進(jìn)行了研究。

1 材料

LPS，按文獻(xiàn)［6］提取，純度為29.2%，硫酸根占糖總量的41.2%，用雙蒸水配成10 mg/mL的溶液，101.3 kPa(121.3℃)滅菌10 min，4℃冰箱保存。

大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞(C6)，中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù);DMEM，Gibco公司;胎牛血清(FBS)，杭州四季青生物工程材料有限公司;胰蛋白酶，Amresco公司;谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)檢測(cè)試劑盒，南京建成生物工程研究所。

MCD-17A型CO2培養(yǎng)箱，日本 Sanyo公司;分光光度計(jì)，美國(guó)PE公司;Leica熒光倒置相差顯微鏡，德國(guó)Leica公司;FACScan型流式細(xì)胞檢測(cè)儀，美國(guó)Becton Dickinson公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

C6細(xì)胞以含10%FBS的DMEM做培養(yǎng)基，37℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿瓶底時(shí)用0.25%胰酶消化，混勻后計(jì)數(shù)，按適當(dāng)密度接種到特定培養(yǎng)器皿中。

2.2 細(xì)胞形態(tài)觀察法和細(xì)胞計(jì)數(shù)法

細(xì)胞以2萬(wàn)個(gè)/孔的密度接種于24孔板中，培養(yǎng)24 h 后加藥，分為對(duì)照組、LPS 50，100，200 μg/mL組。分別繼續(xù)培養(yǎng)24，48，72 h后取出培養(yǎng)板，置于相差顯微鏡下觀察其形態(tài)并拍照。后用0.25%胰酶消化，收集、離心、重懸，用臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)，觀察不同濃度藥物作用下對(duì)C6細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

細(xì)胞以約200萬(wàn)個(gè)/mL接種于大培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h后分為對(duì)照組、LPS組(100 μg/mL)，分別繼續(xù)培養(yǎng)24，48 h后收集細(xì)胞，PI染色后流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同情況下的細(xì)胞周期。

2.4 GSTs測(cè)試

細(xì)胞以(9～10)×10 個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，24 h后加藥。繼續(xù)培養(yǎng)24，48 h。分別將細(xì)胞消化后收集到干凈的試管中，用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液重懸，用超聲波細(xì)胞粉碎儀在0℃粉碎細(xì)胞。取上清按試劑盒說(shuō)明的步驟進(jìn)行酶促反應(yīng)和顯色反應(yīng)，測(cè)定412 nm波長(zhǎng)處的吸光度值，計(jì)算酶活性。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 形態(tài)學(xué)觀察

對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛形態(tài)正常;實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞變化較大，異形性增多，細(xì)胞空泡大量增多，多呈圓形。加藥48 h后，細(xì)胞數(shù)量隨著藥物濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)而減少，培養(yǎng)液中出現(xiàn)較多的漂浮的死細(xì)胞。見(jiàn)圖1。

圖1 LPS處理24～72 h C6細(xì)胞形態(tài)變化(200×)Fig.1 LPS-induced morphological changes of C6 cells(200×)

3.2 LPS對(duì)C6的體外生長(zhǎng)抑制作用

LPS 50～200 μg/mL處理24 h后，對(duì) C6體外增殖的抑制率分別為17.3%，35.1%和50.6%，與對(duì)照組比較差異顯著(P＜0.05);處理48 h后，抑制率分別為55.2%，71.3%和80.6%，與對(duì)照組比較有非常顯著差異(P＜0.01);處理72 h后則更加明顯，抑制率分別達(dá)到92.6%，96.1%和98.9%，與對(duì)照組比較有非常顯著差異(P＜0.01)。LPS對(duì)C6細(xì)胞的增殖抑制作用呈劑量時(shí)間依賴性。見(jiàn)圖2。

3.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同情況下的細(xì)胞周期分布結(jié)果

與對(duì)照組相比，LPS組G0/G1期占細(xì)胞周期的比例逐漸增加，S期占細(xì)胞周期的比例逐漸降低。見(jiàn)圖3。

圖2 LPS處理24～72 h對(duì)C6細(xì)胞的抑制率變化Fig.2 Effect of LPS on cell growth inhibition in C6 cells

3.4 GSTs活性測(cè)定結(jié)果

對(duì)照組細(xì)胞中GSTs的活性較高，加藥24～48 h后與對(duì)照組相比較，LPS組的GSTs隨時(shí)間和濃度依次降低，具有時(shí)間劑量依賴性，見(jiàn)圖4。

圖3 LPS處理對(duì)C6細(xì)胞周期分布的影響Fig.3 Effects of LPS on the cell cycle distribution in C6 cells

圖4 LPS處理的C6細(xì)胞GSTs活性變化Fig.4 GSTs activity in C6 cells after treated with LPS

4 討論

近年來(lái)，新的細(xì)胞毒性藥物的發(fā)展使許多腫瘤治療效果有了明顯改觀。盡管如此，腫瘤細(xì)胞對(duì)多種化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥性，仍是造成化療失敗的主要原因。GSTs與腫瘤的多藥耐藥關(guān)系最為密切［7］。GSTs是一組多功能的藥物代謝酶，能催化親電子物質(zhì)與GSH(谷胱甘肽)結(jié)合，并可與親脂性細(xì)胞毒藥物結(jié)合增強(qiáng)其水溶性，能促進(jìn)藥物排泄而降低抗癌藥的作用。抗癌藥物經(jīng)GSTs代謝后對(duì)癌細(xì)胞的殺傷作用減弱，也就是說(shuō)癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐受力增加［8］。當(dāng)長(zhǎng)期使用抗癌化療藥物時(shí)，癌細(xì)胞中的GSTs水平就會(huì)提高，這種誘導(dǎo)作用將會(huì)導(dǎo)致癌細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)化療藥物的耐藥性，這也是癌細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境的一種表現(xiàn)［9］。本研究中，C6細(xì)胞在加入LPS后GSTs的活性隨著藥物濃度的增加及時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。其作用機(jī)制可能與LPS能夠抑制自由基的產(chǎn)生并加快自由基的清除有關(guān)，從而減少GSHS的生成量，但具體機(jī)制仍不清楚，將有待于進(jìn)一步的研究。

細(xì)胞周期主要由G1、S、G2和M 期組成。G1/S相和G2/M相轉(zhuǎn)換處各有一個(gè)節(jié)點(diǎn)，通過(guò)對(duì)這兩個(gè)節(jié)點(diǎn)的控制可調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)程，使不同的細(xì)胞周期事件在時(shí)間和空間上相互協(xié)調(diào)［10］。本研究結(jié)果表明，LPS主要作用于G1/S節(jié)點(diǎn)，使細(xì)胞停滯于G1期，阻滯G1期細(xì)胞向S期移行，從而使進(jìn)入S期的細(xì)胞數(shù)量減少，S期即DNA合成期。LPS使腫瘤細(xì)胞DNA合成障礙，從而抑制C6細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝增殖等過(guò)程，最終誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。綜上所述，LPS能有效抑制大鼠膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)，使細(xì)胞周期阻抑在G1/S期?？勺鳛閻盒阅X膠質(zhì)瘤治療的輔助治療，減少化療藥物的用量，降低腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率，提高治愈率，從而提高腫瘤患者的生存質(zhì)量。

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