楊 欣，劉 杰，劉 瑛，吳永林，范鳳鳴，劉 輝，張鵬艷，李玉華

(成都生物制品研究所有限責(zé)任公司，四川 成都 610023)

流行型感冒(流感)是一種常見的急性呼吸道傳染病，由甲、乙、丙三型流感病毒引起，接種流感疫苗是預(yù)防流感的有效手段。雞胚尿囊腔接種是常用的流感病毒培養(yǎng)方法，它具有病毒產(chǎn)量高，操作簡(jiǎn)便，經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。然而雞胚尿囊病毒液常含有雞胚中的雜蛋白，其中卵清蛋白是引起疫苗使用者過敏的主要物質(zhì)之一，所以雞胚尿囊病毒液的純化是制備流感疫苗的關(guān)鍵技術(shù)。目前純化病毒的方法主要有超濾法、超速離心法和柱色譜法［1-3］。本文采用中空纖維柱超濾和分子篩色譜的方法純化雞胚流感病毒。

1 材料

750 kD中空纖維超濾系統(tǒng)(Quixstand Benchtop System，GE公司);K50/100柱、P-50泵、Uvis 920檢測(cè)儀、REC 112記錄儀(Phamacia公司)。

流感病毒毒種(H1N1 NYMC X-181 reassortant、H3N2 NYMC X-187 reassortant、B NYMC BX-35 reassortant)、標(biāo)準(zhǔn)抗原及標(biāo)準(zhǔn)抗血清均來自英國國家生物制品檢定所(NIBSC);海藍(lán)白種蛋購自北京藍(lán)風(fēng)養(yǎng)殖有限公司;卵清蛋白ELISA檢測(cè)試劑盒，Seramun Diagnostica GmbH公司產(chǎn)品;預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)，New England Biolabs(NEB)產(chǎn)品;兔抗甲流(H1N1)病毒HA單克隆抗體購自Sino Biological Inc.;羊抗兔IgG(AP標(biāo)記)購自Sigma公司。

2 方法

2.1 單價(jià)流感病毒尿囊液的制備

從工作毒種庫中取毒種1支，1∶10 000倍稀釋，接種于10 d齡雞胚尿囊腔，經(jīng)33～35℃培養(yǎng)48～72 h后，篩選活胚置2～8℃冷胚24 h，收獲病毒尿囊液，尿囊液血凝滴度應(yīng)不低于1∶160，微生物限度檢測(cè)符合《中國藥典》要求［4］。尿囊液中加入甲醛至終濃度1:5 000，2～8℃放置7 d，滅活病毒。

2.2 超濾

將滅活的單價(jià)病毒尿囊液用5，3和1 μm濾器過濾后，再用750 kD中空纖維超濾系統(tǒng)超濾濃縮至50倍，緩沖液為pH 7.2，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)。

2.3 Sepharose 4FF凝膠色譜

用K50/100的Sepharose 4FF凝膠色譜柱，平衡緩沖液和洗脫緩沖液為pH 7.2，0.01 mol/L PBS;流速為15 mL/min;收集洗脫峰，用直接血凝法測(cè)定洗脫峰的血凝滴度，以確定流感病毒峰。

2.4 裂解

在經(jīng)過一次Sepharose 4FF凝膠色譜純化的流感病毒液中加入終濃度為0.6%的Triton N-101，25 ℃ 震搖 2 h［5］。

2.5 血凝滴度測(cè)定

采用直接血凝法，在96孔U型板中每孔加入生理鹽水25 μL，取待檢樣品 25 μL，從第一孔開始做倍比稀釋，最后一孔棄掉液體25 μL，每孔加入1%雞紅細(xì)胞懸液25 μL，同時(shí)做血球?qū)φ?，振蕩均勻后?5℃ 40 min，觀察結(jié)果，50%血球發(fā)生凝集的最高稀釋度為待檢樣品血凝滴度。

2.6 卵清蛋白含量測(cè)定

用卵清蛋白ELISA檢測(cè)試劑盒，按說明書操作，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長處的吸光度值(參比波長620 nm)，然后用直線回歸方程計(jì)算待檢樣品的卵清蛋白含量。

2.7 血凝素含量測(cè)定

采用單向免疫擴(kuò)散法，將適量的標(biāo)準(zhǔn)抗體(參考NIBSC根據(jù)不同型別的流感病毒的推薦量)加入56℃，1.5%瓊脂糖中，倒在玻璃板上，凝固后用直徑為3 mm的打孔器打孔;將待檢樣品和標(biāo)準(zhǔn)抗原用10%Zwittergent 3-14 Detergent裂解劑，室溫裂解30 min，每孔加入樣品 10 μL，擴(kuò)散 24 h，PBS 浸泡 2 h，晾干，0.5%考馬斯亮藍(lán)染色10 min，脫色后測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品和待檢樣品擴(kuò)散圈直徑，采用直線回歸方程計(jì)算。

2.8 SDS-PAGE電泳

濃縮膠4%，分離膠12%，用還原樣品處理液(含 β-巰基乙醇)處理，上樣量 5 μg，200 V 電泳，考馬斯亮藍(lán)染色。

2.9 Western免疫印跡

SDS-PAGE電泳后，用半干電轉(zhuǎn)儀將樣品轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，兔抗甲流(H1N1)病毒HA單克隆抗體加量是 2 μg/mL，AP標(biāo)記到羊抗兔 IgG按1∶5 000加入，用 NBT/BCIP 顯色。

2.10 總蛋白含量測(cè)定

采用 Lowry法測(cè)定［4］。

3 結(jié)果

3.1 中空纖維柱超濾去除卵清蛋白的結(jié)果

用750 kD中空纖維柱超濾濃縮，將分子質(zhì)量較大的流感病毒截流，部分小分子雜質(zhì)如卵清蛋白被去除，達(dá)到濃縮提純的目的。

用此方法超濾了7批流感病毒尿囊液，卵清蛋白去除率在76.53% ～93.66%之間，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示中空纖維柱超濾能有效地去除卵清蛋白等小分子雜蛋白。

表1 中空纖維濾柱超濾病毒尿囊液后卵清蛋白去除率Tab.1 Removal rate of ovalbumin after hollow fiber filtration

3.2 Sepharose 4FF凝膠色譜流感病毒峰的確定

收集Sepharose 4FF凝膠色譜的洗脫峰1和峰2，用直接血凝法測(cè)定洗脫峰血凝滴度，確認(rèn)流感病毒主要在洗脫峰1，見圖1。

圖1 流感病毒第一次Sepharose 4FF凝膠色譜圖Fig.1 The first Sepharose 4FF chromatography of influenza virus

3.3 Sepharose 4FF凝膠色譜上樣量的摸索

凝膠色譜上樣量過多，會(huì)影響分離純化效果。比較了上樣量為柱床體積的3%，4%和5%的分離純化效果，結(jié)果見表2?？梢娚蠘恿啃∮谥搀w積的5%時(shí)，洗脫峰1的卵清蛋白含量、總蛋白含量與血凝素含量的比值均較低，純化效果較好。

3.4 7批流感病毒的純化結(jié)果

采用中空纖維柱超濾濃縮、二次Sepharose 4FF凝膠色譜的純化工藝，純化了7批流感病毒，結(jié)果見表3。純化后流感病毒鑒別試驗(yàn)均與推薦病毒株一致，總蛋白含量與血凝素含量比值小于4.5，卵清蛋白含量也均小于500 ng/mL，符合《中國藥典》的要求［4］。

表2 凝膠色譜不同上樣量純化結(jié)果比較Tab.2 Chromatography results with different amounts of samples

表3 7批流感病毒的純化結(jié)果Tab.3 Purification results of 7 batches of influenza virus

3.5 純化的流感病毒SDS-PAGE電泳和Western免疫印跡

將流感病毒超濾濃縮、一次Sepharose 4FF色譜和二次Sepharose 4FF色譜樣品與英國NIBSC的標(biāo)準(zhǔn)抗原進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果(圖2)顯示，經(jīng)過純化，雜蛋白逐漸減少，二次Sepharose 4FF色譜樣品與英國NIBSC的標(biāo)準(zhǔn)抗原的電泳條帶沒有明顯差別，在47和29 kD處均有明顯的蛋白條帶。Western免疫印跡也顯示，二次Sepharose 4FF色譜樣品(還原和非還原處理)的血凝素條帶與英國NIBSC的標(biāo)準(zhǔn)抗原的一致，在29和76 kD分別有HA2和HA0的特異性條帶(圖3)。

4 討論

圖2 流感病毒純化樣品SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-PAGE of purified influenza virus samples

流感疫苗是用WHO推薦的當(dāng)年流行的流感病毒株制備的，包括H1N1、H2N3和B型流感病毒。本文采用的純化工藝包括中空纖維柱超濾、一次Sepharose 4FF凝膠色譜、裂解和二次Sepharose 4FF凝膠色譜，通過中空纖維超濾，可以去除大部分的卵清蛋白，而且中空纖維超濾是一種較柔和的超濾方法，它的開放流路在濃縮病毒時(shí)不易堵膜且不易聚集。二次Sepharose 4FF凝膠純化，去除了更多的雜蛋白，純化后樣品卵清蛋白殘留量、總蛋白含量與血凝素含量之比值均符合《中國藥典》的要求。該純化工藝操作較蔗糖密度梯度離心操作簡(jiǎn)單，更節(jié)約時(shí)間和成本，還可按比例線性放大數(shù)十至數(shù)百倍，且采用柱色譜技術(shù)純化流感病毒，更容易對(duì)制品生產(chǎn)的中間過程進(jìn)行控制。

圖3 流感病毒純化樣品Western免疫印跡圖片F(xiàn)ig.3 Western blot of purified influenza virus samples

血凝素是流感疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要抗原，它首先在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成分子質(zhì)量為76 kD、含有562～566個(gè)氨基酸的血凝素前體(HA0);隨后HA0分子水解成為HA1(分子質(zhì)量47 kD)和HA2(分子質(zhì)量為29 kD)兩個(gè)多肽，HA1和HA2靠二硫鍵相連［6］。SDS-PAGE電泳時(shí)，用含 β-巰基乙醇樣品處理液處理后，二次Sepharose 4FF色譜樣品與英國NIBSC的標(biāo)準(zhǔn)抗原在47和29 kD處均有明顯的蛋白條帶，而Western免疫印跡使用的兔抗甲流(H1N1)病毒HA單克隆抗體與血凝素的結(jié)合位點(diǎn)在HA2，所以在29和76 kD分別有HA2和HA0的特異性條帶，而HA1未顯色。

綜上，通過上述工藝純化后，3個(gè)型的流感病毒純度均達(dá)到2010版《中國藥典》的要求，而且純化后樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳和Western免疫印跡證實(shí)，電泳條帶和血凝素特異性條帶與購自英國NIBSC的標(biāo)準(zhǔn)品一致。

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［3］ 杜麗娟，王世光，張 立，等.兩種方法純化流感病毒的比較［J］.中國生物制品學(xué)雜志，2007，20(3):216-218.

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［5］ 崩淑芹，劉建華，舒 適，等.流感病毒裂解過程中的形態(tài)變化規(guī)律［J］.中國公共衛(wèi)生，2004，20(7):813-814.

［6］ 郭元吉，程小雯.流行性感冒病毒及其實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］//病毒的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能.北京:中國三峽出版社，1997:16-22.