王 堃，王延亮，盧育新，丁小軍，程曉晨，張慶林

(1.安徽醫(yī)科大學(xué) 研究生院，安徽 合肥 230032;2.北京放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850)

埃博霉素(Epothilone)是黏細(xì)菌纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum)代謝產(chǎn)生的一類十六元大環(huán)內(nèi)酯類化合物，具有與紫杉烷類化合物相似的穩(wěn)定微管的作用機(jī)理［1］，但其抗腫瘤譜更廣，對多藥耐藥性細(xì)胞(包括耐紫杉醇類的細(xì)胞)具有明顯的細(xì)胞毒活性［2］。目前，已有埃博霉素同系物已經(jīng)被美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)用于治療對紫杉醇耐藥的乳腺癌［3］。埃博霉素 B(Epothilone B，Epo B)通過誘導(dǎo)微管蛋白聚合抑制其解聚，穩(wěn)定微管結(jié)構(gòu)，阻礙紡綞絲的形成，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長［4］。

超高效液相色譜(UPLC)技術(shù)是近年發(fā)展起來的分離技術(shù)，已成為天然藥物中活性成分的快速分離和鑒定的有力手段［5］。UPLC具有超高壓、超高靈敏度、超高分離度等特點(diǎn)［6］。飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀(Q-TOF/MS)的顯著特點(diǎn)是高靈敏度、高選擇性，能得到高質(zhì)量質(zhì)譜圖和化合物精確分子質(zhì)量［7］。UPLC與Q-TOF/MS聯(lián)用技術(shù)(UPLC/Q-TOF/MS)是目前分析復(fù)雜系統(tǒng)的有效方法［8］。

目前，Epo B主要時(shí)通過微生物發(fā)酵的方法來獲得。在以前的研究中我們建立了Epo B高效液相色譜(HPLC)分析方法［9］。UPLC-MS/MS較 HPLC分析時(shí)間短，樣品用量小，溶劑的消耗少，提高了靈敏度和分離效率。本文在前期研究的基礎(chǔ)上，用UPLC-MS/MS對Epo B純化產(chǎn)品及發(fā)酵液提取物進(jìn)行分析，為Epo B純化產(chǎn)品的質(zhì)量控制，發(fā)酵液中Epo B的產(chǎn)量及高產(chǎn)菌株的篩選研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料

Epo B對照品、Epo A對照品、Epo B純化產(chǎn)品、發(fā)酵液提取物，自制;甲醇(色譜純)，美國Fisher公司;甲酸(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;超純水經(jīng)Millipore純水系統(tǒng)純化。

UPLC-MS/MS聯(lián)用系統(tǒng)、Waters ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀(包括光電二極管陣列(PDA)檢測器、自動進(jìn)樣系統(tǒng)及恒壓泵動力系統(tǒng))、Waters AcquitySynapt MS系統(tǒng)，美國 Waters公司;Millipore Simplicity純水儀。

2 方法

2.1 對照品溶液

取Epo B及Epo A對照品約10.0 mg，精密稱定，分別用甲醇溶解，配制成濃度約為2.0 mg/mL的對照品溶液，分別吸取1 mL，混合，配制成混合對照品溶液，供篩選UPLC分析條件用。

2.2 樣品溶液

稱取Epo B純化產(chǎn)品6.4 mg，用甲醇溶解，配制成濃度約為2.0 mg/mL的供試液。

實(shí)驗(yàn)室搖瓶發(fā)酵液(4 L)，用大孔樹脂吸附后取適量，乙酸乙酯提取后減壓濃縮，濃縮物甲醇溶解后離心取上清，作為發(fā)酵提取物的供試液。

2.3 UPLC色譜條件

采用Waters ACQUITY UPLC?HSS T3(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)色譜柱;柱溫為30 ℃，流速為0.3 mL/min;流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為甲醇，梯度洗脫程序?yàn)?～2 min，40%B;2～5 min，40%→60%B;5～7 min，60%→70%B;7～10 min，70%→100%B;10～13 min，100%B;13～15 min，100%→40%B。

2.4 質(zhì)譜條件

采用電噴霧電離離子源(ESI)，負(fù)離子V模式檢測;m/z范圍為70～1 200，毛細(xì)管電壓為3 kV，錐孔電壓為40 kV，離子源溫度為100℃，脫溶劑溫度為450℃，脫溶劑氣體流速為900 L/h，錐孔氣流量50 L/h，質(zhì)量校正 m/z 554.261 5。

3 結(jié)果與討論

3.1 Epo A和Epo B混合對照品溶液UPLC分析

取Epo A和Epo B的混合對照品溶液(約0.5 mg/mL)采用2.3項(xiàng)下的的色譜條件進(jìn)行UPLC分析，進(jìn)樣量為2.0 μL。色譜圖見圖1。Epo A的保留時(shí)間(tR)為3.915 min，Epo B 為4.320 min，兩者能夠?qū)崿F(xiàn)基線分離。

本實(shí)驗(yàn)分別考察了甲醇-0.1%甲酸溶液恒比和甲醇-0.1%甲酸溶液梯度條件，結(jié)果顯示甲醇-0.1%甲酸溶液梯度洗脫時(shí)各峰的分離度較好，且基線平穩(wěn)，峰型較好有利于進(jìn)一步的分析，因此最終選擇甲醇-0.1%甲酸溶液梯度洗脫作為流動相系統(tǒng)。

圖1 Epo A和Epo B的混合對照品梯度洗脫UPLC-PDA圖Fig.1 The UPLC-PDA spectrum by gradient elution of Epo A and Epo B

3.2 Epo A和Epo B混合對照品溶液質(zhì)譜分析

將Epo A和Epo B的混合對照品溶液逐步稀釋制成約1 μg/mL的溶液，按2.4項(xiàng)下的質(zhì)譜條件質(zhì)譜分析，進(jìn)樣量為1.0 μL。從圖2中可以看出Epo A 的［M-H］-為 492.243 0，［M+HCOO］-為538.249 0，理論分子質(zhì)量為493.249 8，Epo B的［M-H］-為506.259 8，［M+HCOO］-為552.264 3，理論分子質(zhì)量為507.265 5。

圖2 Epo A和Epo B的混合溶液稀釋后質(zhì)譜分析圖Fig.2 The mass spectrum of the mixed solution of the Epo B and Epo A

3.3 Epo B純化產(chǎn)品的UPLC-MS分析

精密量取濃度約為2.0 mg/mL的Epo B純化產(chǎn)品供試液1.0 μL，注入色譜儀。結(jié)果見圖3～4。由圖3中可知，Epo B純化產(chǎn)品用UPLC-MS分析，經(jīng)檢測PDA圖譜與總離子流色譜圖(TIC)圖譜保留時(shí)間一致，除了主成分 Epo B(tR=4.41min，［MH］-=506.259 9，［M+HCOO］-=552.266 6)外，提取離子圖還能檢測出微量的主要雜質(zhì)Epo A存在(tR=3.98 min，［M-H］-=492.244 9，［M+HCOO］-=538.248 6)。

目前EpoB主要通過大孔樹脂提取分離再經(jīng)HPLC純化制得，純化后應(yīng)用UPLC-MS對Epo B進(jìn)行檢測、分析對于改進(jìn)分離制備工藝提高純度以及雜質(zhì)鑒定具有指導(dǎo)意義。

圖3 Epo B純化產(chǎn)品供試液UPLC-PDA及TIC圖譜Fig.3 The UPLC-PDA and TIC spectrum of the purified products

圖4 Epo B純化產(chǎn)品供試液的質(zhì)譜圖Fig.4 The mass spectrum of Epo B purified product

3.4 UPLC-MS分析發(fā)酵液提取物

精密量取發(fā)酵提取物的供試液1.5 μL，注入色譜儀，結(jié)果見圖5～6。由圖5可知，發(fā)酵液提取物供試液主成分Epo B的tR=4.40 min，已知雜質(zhì)Epo A的tR=3.99 min，與其他雜質(zhì)可以基線分離，提取與對照品tR一致的譜峰，質(zhì)譜圖與圖2一致。

目前，Epo B主要通過微生物發(fā)酵方法獲得。應(yīng)用UPLC-MS對發(fā)酵過程中Epo B的含量進(jìn)行跟蹤檢測，對于改進(jìn)工藝，提高代謝物產(chǎn)量具有重要的指導(dǎo)意義，也可用于篩選高產(chǎn)菌株。

圖5 Epo B發(fā)酵液提取物供試液UPLC-PDA及TIC圖譜Fig.5 The UPLC-PDA and TIC spectrum of the fermentation broth extracts

圖6 Epo B發(fā)酵液提取物供試液的主成分質(zhì)譜圖Fig.6 The mass spectrum of Epo A and Epo B in the fermentation broth extracts

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