趙 明，嵇 楊，高 錦，劉 俊，程 洋，趙春杰

(1.沈陽(yáng)藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016;2.總后勤部衛(wèi)生部藥品儀器檢驗(yàn)所，北京 100071)

胞磷膽堿鈉葡萄糖注射液(CG)和胞磷膽堿鈉氯化鈉注射液(CS)兩種大容量注射劑是《中國(guó)藥典》2010年版新收載品種［1］。國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局國(guó)食藥監(jiān)注［2008］7號(hào)發(fā)布化學(xué)藥品注射劑和多組分生化藥注射劑基本技術(shù)要求中明確“大容量注射劑應(yīng)采取終端滅菌工藝，建議首選過(guò)度殺滅法(F0≥12)，如產(chǎn)品不能耐受過(guò)度殺滅的條件，可考慮采用殘存概率法(8≤F0＜12)，但均應(yīng)保證產(chǎn)品滅菌后的SAL(無(wú)菌保證水平)不大于10-6。采用其它F0值小于8的終端滅菌條件的工藝，原則上不予認(rèn)可”［2］。本課題組在對(duì)小容量胞磷膽堿鈉(CDPC)注射劑的質(zhì)量研究中發(fā)現(xiàn)，CDPC對(duì)高溫敏感，滅菌溫度高于105℃時(shí)，其有關(guān)物質(zhì)水平顯著增加。本文考察滅菌溫度與時(shí)間對(duì)該兩種大容量注射劑的穩(wěn)定性及安全性的影響，以便為該產(chǎn)品生產(chǎn)時(shí)選擇適宜的滅菌工藝提供參考和依據(jù)。

1 儀器與藥品

Agilent 1100高效液相色譜儀、Agilent Chemstation色譜工作站，Agilent公司;UV-2550紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，島津公司。

CDPC原料藥(日本協(xié)和發(fā)酵株式會(huì)社，R1004004，含量為100.7%)，北京四環(huán)科寶有限公司提供;5'-胞苷酸對(duì)照品，中國(guó)藥品生物制品檢定所;5%葡萄糖注射液(批號(hào):100805401)、氯化鈉注射液(批號(hào):100819167)，石家莊四藥有限公司;滅菌注射用水(批號(hào):091221)，惠達(dá)藥業(yè)有限責(zé)任公司;四丁基氫氧化銨及磷酸二氫鉀均為分析純。

KM小鼠，SPF級(jí)，雌性，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK-(軍)2007-004。

2 方法

《中國(guó)藥典》2010版中收載4種規(guī)格CG和4種規(guī)格CS，其中CG有兩個(gè)規(guī)格的濃度相同，故本實(shí)驗(yàn)?zāi)M7種規(guī)格樣品進(jìn)行滅菌穩(wěn)定性及安全性考察。

稱取CDPC原料藥，分別用5%葡萄糖注射液或氯化鈉注射液稀釋至相應(yīng)濃度，在5種條件下滅菌，檢測(cè)滅菌前后樣品的pH值、有關(guān)物質(zhì)、吸收差值及小鼠毒性，分組類型見(jiàn)表1。另取5%葡萄糖注射液、氯化鈉注射液，并配制2.5 mg/mL CDPC溶液，在滅菌前及121℃滅菌30 min后直接測(cè)定上述三種對(duì)比溶液的相關(guān)指標(biāo)。

表1 試驗(yàn)分組類型表Tab.1 The table of experimental groups

2.1 pH測(cè)定

依法測(cè)定各樣品滅菌前后的pH值［1］。藥典規(guī)定CG和CS的pH值分別為4.5～6.5和5.5～7.5。

2.2 HPLC法檢查有關(guān)物質(zhì)

按《中國(guó)藥典》2010版二部中CG(CS)項(xiàng)下有關(guān)物質(zhì)檢查方法［1］進(jìn)行檢查。限度要求為5'-胞苷酸含量≤0.3%，其他單個(gè)雜質(zhì)含量≤0.5%，其它總雜質(zhì)含量≤0.7%。

2.3 吸光度測(cè)定

取滅菌前后的各樣品溶液直接檢測(cè)。由于CDPC具有很強(qiáng)的紫外吸收，而在波長(zhǎng)≥340 nm處基本無(wú)吸收，選擇340～700 nm掃描可檢測(cè)其無(wú)紫外吸收的雜質(zhì)情況，并選擇用340和700 nm吸光度差值表示測(cè)定結(jié)果，可有效降低干擾。

2.4 小鼠急性毒性試驗(yàn)

根據(jù)有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果，對(duì)滅菌后有關(guān)物質(zhì)不合格組別的樣品進(jìn)行小鼠急性毒性試驗(yàn)，每組5只小鼠(17～20 g)，每只小鼠分別給予供試品溶液(滅菌后的原液)0.5 mL，給藥途徑為尾靜脈注射，觀察即刻和48 h內(nèi)小鼠的反應(yīng)及死亡情況。

3 結(jié)果

3.1 pH值測(cè)定結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)表2。與未滅菌樣品的pH值相比，高壓滅菌后樣品的pH值有不同程度的下降。

3.2 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)表2。滅菌前3個(gè)規(guī)格的CG有關(guān)物質(zhì)均符合要求，規(guī)格為2.5，2 mg/mL CG在F0＞12(第3～5)滅菌條件下和規(guī)格為0.5 mg/mL CG在F0＞8(第1～5)滅菌條件下滅菌后，有關(guān)物質(zhì)超過(guò)藥典規(guī)定的限度。滅菌前4個(gè)規(guī)格的CS有關(guān)物質(zhì)均符合要求，含量最小規(guī)格樣品(1 mg/mL)在121℃滅菌20，30 min(第4～5 滅菌條件，F(xiàn)0≥19.5)后有關(guān)物質(zhì)略超過(guò)限度，另3個(gè)規(guī)格CS在5種條件下滅菌后有關(guān)物質(zhì)均符合要求。

表2 胞磷膽堿鈉葡萄糖注射液和氯化鈉注射液滅菌前后pH值、有關(guān)物質(zhì)及吸光度差值測(cè)定結(jié)果Tab.2 pH value，related substances content and absorption of Citicoline Sodium and Glucose Injection and Citicoline Sodium and Sodium Chloride Injection before and after sterilization

3.3 吸光度差值測(cè)定結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)表2。在340～700 nm下進(jìn)行紫外-可見(jiàn)光譜掃描，滅菌前后CS(4個(gè)規(guī)格)樣品在340和700 nm波長(zhǎng)處吸光度差值均為0。CG(3個(gè)規(guī)格)滅菌前樣品在340和700 nm波長(zhǎng)處吸光度差值為0;5種條件下滅菌后樣品在340和700 nm波長(zhǎng)處吸光度差值為0.027～0.074，并且隨著F0值增大，吸光度差值有隨之增大的趨勢(shì)。

3.4 小鼠毒性反應(yīng)

注射樣品后即刻及48 h內(nèi)觀察小鼠反應(yīng)，小鼠未出現(xiàn)異常反應(yīng)，48 h內(nèi)沒(méi)有小鼠死亡，說(shuō)明大輸液滅菌后有關(guān)物質(zhì)雖然超過(guò)藥典規(guī)定限度，但未引起小鼠急性毒性。

3.5 對(duì)比溶液的相關(guān)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)表3。經(jīng)高壓滅菌后，CDPC溶液與5%葡萄糖注射液的pH值下降，0.9%氯化鈉注射液pH值無(wú)變化。CDPC溶液與0.9%氯化鈉溶液的吸光度差值不變，5%葡萄糖溶液的吸光度差值增加。

表3 胞磷膽堿鈉溶液、5%葡萄糖注射液、0.9%氯化鈉注射液滅菌前后pH值和吸光度差值測(cè)定結(jié)果Tab.3 pH value and absorption of citicoline sodium solution，5%Glucose Injection，0.9%Sodium Chloride Injection before and after sterilization

4 討論

與CS相比，滅菌后的CG的pH值降幅較大。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)CG經(jīng)高壓滅菌后pH值明顯降低不僅與主成分降解有關(guān)，葡萄糖的降解產(chǎn)物也一定程度降低了樣品的pH值。文獻(xiàn)［3-4］表明，葡萄糖注射液的滅菌條件應(yīng)控制在115℃，30 min或110℃，30～45 min，并及時(shí)降溫出鍋，中間產(chǎn)品的pH值控制在3.8～4.2，可減少葡萄糖的分解。但F0值＜8的終端滅菌條件達(dá)不到大容量注射劑的滅菌要求，且過(guò)低的pH值也會(huì)影響CDPC的穩(wěn)定性。故選擇CS作為大容量注射劑較好，同時(shí)應(yīng)監(jiān)控中間產(chǎn)品的pH值，并酌情調(diào)整，以滿足最終產(chǎn)品的pH值要求。

CG的三個(gè)規(guī)格中，規(guī)格為2.5和2 mg/mL在F0＞12滅菌條件下滅菌后，有關(guān)物質(zhì)超過(guò)藥典規(guī)定的限度，因此該2種規(guī)格CG滅菌條件不宜選擇F0＞12的過(guò)度殺滅法。采用殘存概率法滅菌，有關(guān)物質(zhì)檢查符合藥典規(guī)定，所以可考慮采用殘存概率法進(jìn)行滅菌，但應(yīng)保證產(chǎn)品滅菌后的SAL≤10-6。規(guī)格為0.5 mg/mL的CG在F0＞8滅菌條件下，有關(guān)物質(zhì)即超過(guò)藥典規(guī)定的限度，表明不適宜選擇終端滅菌工藝，該規(guī)格CG的合理性有待考察。CG中CDPC濃度越低的樣品在5種滅菌條件下滅菌后有關(guān)物質(zhì)增幅越大，表明配制的濃度應(yīng)適宜，并選擇相應(yīng)適宜的滅菌條件。而CS的4個(gè)規(guī)格中，僅1 mg/mL的CS在F0≥19.5滅菌條件下，有關(guān)物質(zhì)超過(guò)限度，表明該規(guī)格適于選擇F0＜19.5的過(guò)度殺滅法，其余3種規(guī)格在5種滅菌條件下有關(guān)物質(zhì)均符合限度要求。因此選擇CS作為大容量注射液較好，能滿足大輸液的終端滅菌要求，有關(guān)物質(zhì)也符合限度要求。

在對(duì)小容量CDPC注射劑的研究中發(fā)現(xiàn)，CDPC注射劑(125 mg/mL)在高壓滅菌后會(huì)產(chǎn)生無(wú)紫外吸收的雜質(zhì)，因此測(cè)定5種條件下滅菌前后樣品在340和700 nm波長(zhǎng)處的吸光度差值，分析終端滅菌過(guò)程與大輸液中無(wú)紫外吸收雜質(zhì)的產(chǎn)生之間的相關(guān)性。結(jié)果表明CDPC溶液(2.5 mg/mL)吸光度差值無(wú)明顯變化，原因可能是CDPC濃度較低，經(jīng)高壓滅菌后產(chǎn)生的無(wú)紫外吸收雜質(zhì)較少。與CS相比，滅菌后的CG的吸光度差值較大。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，CDPC溶液(2.5 mg/mL)并未引起吸光度差值的變化，推測(cè)吸光度差值的增加可能是葡萄糖在高壓滅菌過(guò)程中產(chǎn)生糠醛類物質(zhì)所引起的，因此選擇CS作為大容量注射液較好。

［1］ 中國(guó)藥典(二部)［S］.2010:603-604.

［2］ 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.關(guān)于發(fā)布化學(xué)藥品注射劑和多組分生化藥注射劑基本技術(shù)要求的通知［EB］.2008-01-10.http://www.sda.gov.cn/WS01/CL0055/27800.html.

［3］ 彭永林.葡萄糖輸液滅菌后濃度下降探討［J］.中國(guó)藥事，2000，14(6):402.

［4］ 鄭 怡，潘碧英.葡萄糖輸液滅菌穩(wěn)定性探討［J］.海峽藥學(xué)，1994，6(4):84.