孫海燕，羅菊珍，劉 冬

(深圳職業(yè)技術學院，廣東 深圳 518055)

降血壓肽(antihypertensive peptide，AHP)是一類與血管緊張素轉化酶抑制劑具有相同降壓機制的小分子多肽，由于降血壓效果顯著且無毒副作用，因而成為一種極具開發(fā)潛力的多肽類抗高血壓藥物［1］。本實驗室已成功利用基因工程技術高效制備出重組降血壓肽(recombinant antihypertensive peptide，rAHP)。動物試驗表明，自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)給rAHP 2 h后，收縮壓顯著降至最低，12 h后血壓恢復到給藥前水平，降壓效果呈現(xiàn)較為明顯的“峰谷”波動，不利于高血壓患者的平穩(wěn)降壓［2-3］;利用Caco-2模型對其吸收機制的研究表明，rAHP主要以旁路轉運方式被小腸上皮細胞吸收，生物利用度在1%以下［4-5］。為提高rAHP的生物利用度、延長藥物作用時間和平穩(wěn)降壓，本研究選用可生物降解的聚乳酸(PLA)為載體材料，利用復乳-液中干燥法研制rAHP緩釋微球，通過微球配方設計、優(yōu)化制備工藝及對體內(nèi)外釋放特性和降壓效果的評價，以期開發(fā)出具有臨床應用價值的rAHP緩釋新制劑。

1 材料

rAHP(序列為VLPVPR)，本實驗室通過基因工程方法制得，純度≥99%;聚乙烯醇124(PVA)，國藥集團化學試劑有限公司;PLA(黏均分子質(zhì)量80 000)，本院精細化工實驗室提供;乙腈和三氟乙酸為色譜純;其他試劑均為市售分析純。

LC 20-A高效液相色譜儀，日本島津公司;ALPHA 2-4真空冷凍干燥機，德國 CHRIST公司;H550S顯微照相系統(tǒng)，日本 Nikon公司;IX71-A21PH倒置顯微鏡，日本Olympus公司;S3500激光粒度分析儀，美國Microtrac公司。

2 方法

2.1 微球的制備

采用復乳-液中干燥法制備［6］。將適量 rAHP溶解于水中作為內(nèi)水相，PLA溶解于二氯甲烷作為油相，兩者在冰浴中高速機械攪拌5 min得W1/O初乳。在800 r/min磁力攪拌下將初乳倒入一定濃度的PVA溶液100 mL中，攪拌10 min，得到W1/O/W2復乳。在25℃下繼續(xù)攪拌5 h，揮發(fā)有機溶劑固化微球，離心洗滌后冷凍干燥得到rAHP微球。

2.2 rAHP的測定

采用高效液相色譜(HPLC)法［7］測定。

2.2.1 色譜條件 色譜柱:VYDAC 238EV54 C18(200 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈-水-三氟乙酸(17∶83∶0.05);流速:1.0 mL/min;檢測波長:199 nm;柱溫:30 ℃;靈敏度:0.01AUFS;進樣量:20 μL。

2.2.2 標準曲線的制備 稱取適量rAHP，用水配制成 25，125，250，375，500 和 625 μg/mL 的標準溶液。測定rAHP的峰面積，以濃度(C)與峰面積(A)作線性回歸。回歸方程為:A=2.668×106C+9.302×104，r=0.999 9，可見，rAHP 在25 ～625 μg/mL 濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好。最低檢測濃度為12 ng/mL。

2.3 微球包封率和載藥量的測定

2.3.1 包封率測定 微球凍干后，加水適量分散，離心，上清液加水至50 mL，HPLC法測定，記錄色譜圖，量取峰面積，由標準曲線，計算出上清液中游離rAHP的量，并計算包封率［8］。包封率=(投藥量-游離藥量)/投藥量×100%。

2.3.2 載藥量測定

2.3.2.1 校準曲線的制備 用空白微球的二氯甲烷溶液(空白微球10 mg/mL)配制成濃度分別為25，50，100，200，250 和 500 μg/mL(真實值)的rAHP溶液，分別取1 mL，加水3 mL萃取，各萃取3次，合并萃取液，HPLC法測定，記錄色譜圖，量取峰面積，由標準曲線計算萃取液中rAHP含量(測量值)。以真實值(X)對測量值(Y)進行線性回歸，得微球載藥量校準曲線方程:Y=0.960 9 X+0.000 6，r=0.999 4。

2.3.2.2 測定方法 準確稱取載藥微球10 mg，用二氯甲烷1 mL溶解，然后加水3 mL萃取，萃取3次，合并萃取液，加水至50 mL，HPLC法測定，記錄色譜圖，量取峰面積，根據(jù)標準曲線計算萃取液中rAHP含量，然后根據(jù)校準曲線計算微球中rAHP的真實含量，計算載藥量［8］。載藥量=(微球中藥物含量/微球干重)×100%。

2.4 微球粒徑及粒徑分布測定

取微球適量，加水分散，用激光粒度分析儀測定微球的粒徑和粒徑分布。粒徑分布用跨度(Span)表示［6］?？缍戎翟叫。６确植荚秸?，微球越均勻。

2.5 微球制備工藝優(yōu)化

根據(jù)單因素實驗結果，確定油相中PLA的濃度(CPLA)、初乳攪拌速度(Vstir)、內(nèi)水相與油相體積比(Rw/o)以及外水相PVA濃度(C'PVA)等對微球特性影響最大，以此四個因素進一步做L9(34)正交實驗優(yōu)化(見表1)。

表1 L9(34)正交實驗因素水平表Tab.1 Orthogonal experiment at L9(34)

用包封率(S1)、微球得率(S2)、粒徑分布跨度(S3)為指標對微球進行評價，其中包封率、得率都是越大越好，跨度則越小越好。采用歸一化法，把這S1、S2和S3三個指標轉化為綜合評價指標 S［6］。

2.6 微球的體外釋放度試驗

分別精密稱取微球10 mg，置10 mL具塞離心管中，加入pH為7.4的磷酸緩沖液(含0.02%疊氮化鈉)5 mL，密封，于37℃水浴中低速恒溫震蕩，震蕩頻率為50次/min，前2天選取開始后的0.5，2，8，16，24和48 h為取樣點，第3天后的每一天都在同一時間點取樣一次，取樣時每支離心管800 r/min離心2 min，取上清100 μL，用HPLC法檢測上清液中rAHP的含量，并計算釋放度。取樣后離心管中分別補加磷酸緩沖液100 μL，繼續(xù)恒溫震蕩。

3 結果與討論

3.1 微球制備工藝優(yōu)化結果

正交試驗結果見表2。結果表明，微球制備的最優(yōu)工藝為:油相中PLA的濃度為7.5%、初乳攪拌速度為900 r/min、內(nèi)水相與油相體積比為1∶10，外水相PVA濃度為5%。此時綜合評價指標S值最大。

表2 微球制備正交試驗結果(n=3)Tab.2 The results of orthogonal experiments(n=3)

3.2 優(yōu)化工藝所得rAHP-PLA微球的特性

按優(yōu)化后的處方和工藝制得3批微球，所制備載藥微球的包封率為(81.35±1.30)%，載藥量為(10.92±0.37)%，微球得率為(80.26±2.35)%，3批微球的平均粒徑分布范圍在75～80 μm之間，跨度小，粒徑分布比較均勻。顯微照相系統(tǒng)下拍得的微球照片如圖1所示。可以看出，微球呈白色粉末狀，表面光滑，成球圓整，分散性好，大小均勻，沒有明顯聚集現(xiàn)象。微球的粒徑累積分布圖見圖2，結果顯示微球的平均粒徑分布范圍在75～80 μm之間。

圖1 優(yōu)化工藝所得rAHP-PLA微球在顯微照相系統(tǒng)下的照片F(xiàn)ig.1 Pictures of the rAHP-PLA microspheres made by optimal preparation technology

圖2 微球的粒徑分布圖Fig.2 The particle diameter distribution of the microspheres

3.3 優(yōu)化工藝所得rAHP-PLA微球的體外釋放度

rAHP-PLA緩釋微球的15 d內(nèi)體外釋藥情況見圖3。從釋放曲線可以看出，rAHP緩釋微球的釋藥過程主要分為四個階段:第一階段是前24 h，此階段是快速釋放期，累積釋放率達到49.5%。此階段主要是微球表面或近表面存在的藥物溶解在釋放介質(zhì)中，及通過微球孔洞直接釋放出來的藥物［9-11］。24～144 h期間是微球體外釋放的第二階段，即釋放延緩期，這一期間對應的曲線走向很平緩，即微球平緩釋放，累積釋放率只提高了約十個百分點，其原因可能是微球的體外釋放處于藥物的擴散過程，即藥物從微球經(jīng)水解形成的多孔結構內(nèi)擴散或緩慢遷移，因而釋放平緩。第三階段是在144～240 h期間，這是加速釋放期。在這期間曲線走勢又開始迅速攀升，表現(xiàn)為微球的累積釋放率從61.6%迅速上升到91.4%以上，上升了30個百分點。這一階段隨著PLA的不斷水解，其分子質(zhì)量會逐漸降低到某一限度，這樣就導致了骨架溶蝕效應的出現(xiàn)［12-13］。此時，PLA微球的骨架松散，水分大量滲入，致使微球的釋藥速率加快。第四階段是240 h后的緩慢釋放階段，此階段藥物一直處于緩慢速度釋放，其原因可能是當微球經(jīng)過溶蝕效應而導致骨架崩潰后，崩潰的骨架里殘留的少量藥物(10%以下)由于濃度低而緩慢溶解釋放于介質(zhì)中。

4 結論

本文以PLA為材料，探討了制備rAHP緩釋微球的可行性。結果表明，按最優(yōu)工藝和配方制備的rAHP微球包封率為81.35%，載藥量為10.92%，微球得率為80.26%。所制得的微球表面光滑圓整，分散性良好，粒徑的平均分布范圍在75～80μm之間，跨度小，粒徑分布比較均勻。

體外釋藥試驗顯示，rAHP-PLA緩釋微球的釋藥過程包括0～24 h內(nèi)的快速釋放期、24～144 h內(nèi)的緩慢釋放期、144～240 h內(nèi)的加速釋放期及240 h后緩慢釋放期四個階段。其中在前0.5 h藥物累積釋放率為17.5%，360 h累積釋放率達到98.6%，滿足我國藥典對緩釋制劑的指導原則要求［14］，適合于進一步開發(fā)為符合臨床治療需要的中長效注射制劑。本研究為解決多肽藥物應用的瓶頸，促進降血壓肽的臨床使用提供了重要的實驗基礎。

圖3 載藥微球的體外釋放情況Fig.3 The release of the rAHP-PLA microspheres in vitro

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