黃 莉，吳小曼，紀(jì) 宇，王 玉，

(1.中國(guó)藥科大學(xué)，江蘇 南京210009;2.江蘇省食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇 南京 210008)

中醫(yī)將經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的加工炮制后的人胎盤稱為“紫河車”，《本草綱目》記載其“味甘、咸、性溫”，具有“安神養(yǎng)血、補(bǔ)氣、益精、解毒、補(bǔ)血”的作用。此后的中醫(yī)古籍中均將其作為入藥上品，沿用至今［1］，已有數(shù)百年歷史，且在不斷延伸、擴(kuò)展。

胎盤多肽注射液為無(wú)色至淡黃色澄明液體，是健康人胎盤經(jīng)剔除結(jié)締組織后，搗碎、勻漿、透析、超濾、滅菌而成，主要成分為氨基酸、活性肽、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)脂肪酸、核酸以及各種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子等，主要成分的分子質(zhì)量為3 000～5 000，能增強(qiáng)細(xì)胞的免疫功能，抑制機(jī)體的過(guò)氧反應(yīng)，以及促進(jìn)骨髓造血細(xì)胞的生存、增殖、分化及提高生物活性。用于細(xì)胞免疫功能降低或失調(diào)引起的疾病、手術(shù)愈合、細(xì)胞性感染引起的疾病及各種原因所致的白細(xì)胞減少癥等。

目前，胎盤多肽注射液質(zhì)量控制一般采用測(cè)定總氮量的方法，而胎盤多肽注射液作為一種生物提取藥物，其成分復(fù)雜，僅靠少量指標(biāo)成分的含量測(cè)定并不能對(duì)胎盤多肽注射液質(zhì)量進(jìn)行有效的控制。通過(guò)游離氨基酸和水解后總氨基酸含量的測(cè)定，可以從一定程度上反應(yīng)出胎盤多肽注射液的質(zhì)量，兩者之差還可以計(jì)算出注射液中多肽的大致含量。陳柏林等［2］用HPLC Pico-Tag法分析了人胎盤的氨基酸成分，李東浩等［3］用 GC/MS法從胎盤注射液中分離出18個(gè)組分，通過(guò)計(jì)算機(jī)檢索和人工解析，鑒定出14種氨基酸。他們的衍生方法操作相對(duì)復(fù)雜，且所用樣品大多為自制的胎盤樣品，差異較大，不具代表性。6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞氨基甲酸酯(AQC)是一種專門用于氨基酸測(cè)定的衍生化試劑，雖然出現(xiàn)的比較晚，但已經(jīng)被越來(lái)越多的人所接受，該方法適用性較強(qiáng)，適合于復(fù)雜樣品中的氨基酸分析，具有靈敏度高、衍生物穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)選用AQC柱前衍生高效液相色譜法，對(duì)胎盤多肽注射液進(jìn)行了包括天門冬酰胺和谷氨酰胺在內(nèi)的21種常見氨基酸的定量測(cè)定。

1 儀器與試藥

Agilent 1200 series高效液相色譜儀，配置二極管陣列檢測(cè)器;KH-250DB型數(shù)控超聲波清洗器(江蘇昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司);LGJ-10型冷凍干燥機(jī)(鞏義市英峪予華儀器廠);Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)。

天門冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、絲氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、蘇氨酸(Thr)、賴氨酸(Lys)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Tyr)、蛋氨酸(Met)、纈氨酸(Val)、色氨酸(Try)、苯丙氨酸(Phe)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、精氨酸(Arg)、天門冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、色氨酸(Trp)和γ-氨基丁酸(GABA)等21種氨基酸對(duì)照品，中國(guó)藥品生物制品檢定所;內(nèi)標(biāo)α-氨基丁酸(AABA)，美國(guó)Sigma公司;AccQ·Fluor衍生試劑盒(包括硼酸緩沖液Buffer 1，衍生劑粉末2A，衍生劑稀釋液2B)，美國(guó)Waters公司;乙腈為色譜純;水為去離子超純水。

胎盤多肽注射液由貴州黔峰生物制品有限責(zé)任公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Phenomenex Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱;流動(dòng)相A為140 mmol/L醋酸銨緩沖液(用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至5.10)，流動(dòng)相B為乙腈-水(57∶43)，按表1進(jìn)行梯度洗脫;柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)248 nm，進(jìn)樣量5 μL。結(jié)果表明在此色譜條件下21種氨基酸可以獲得良好分離(圖1A)。

表1 胎盤多肽注射液的洗脫條件Tab.1 Elution conditions of placenta polypeptide injection

圖1 21種混合氨基酸對(duì)照品溶液(A)、游離氨基酸(B)和水解后總氨基酸(C)的色譜圖Fig.1 Chromatograms of 21 amino acid standards(A)，free amino acids(B)and total amino acids after hydrolysis(C)

2.2 溶液配制

2.2.1 衍生化試劑的制備 精密量取AccQ·Fluor 2B試劑2 mL，加入含衍生化試劑的AccQ·Fluor 2A瓶中，加蓋密封，旋渦混合10 s，55℃加熱10 min，直至衍生化試劑粉末全部溶解，即得濃度5 mmol/L的AccQ·Fluor衍生試劑，置干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 對(duì)照品混合儲(chǔ)備液 分別取18種氨基酸對(duì)照品(Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Arg、Ala、Pro、Tyr、Cys2、Val、Met、Ile、Leu、Lys、Phe 和 GABA)適量，精密稱定，置于同一量瓶中，0.1 mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋至刻度，制成濃度均約為5 mmol/L(胱氨酸的濃度約為2.5 mmol/L)的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置4℃冰箱中備用。Gln、Asn和Trp儲(chǔ)備液使用前，按上述方法另行單獨(dú)配制，濃度均約為5 mmol/L。

2.2.3 內(nèi)標(biāo)溶液 取AABA約25 mg，精密稱定，加0.1 mol/L鹽酸溶液50 mL溶解，混勻。

2.2.4 游離氨基酸供試品溶液 將胎盤多肽注射液進(jìn)行冷凍干燥，干燥后稱取約一支的重量，加入內(nèi)標(biāo)溶液50 μL，加水至1 mL，得到游離氨基酸的供試品溶液。

2.2.5 水解氨基酸供試品溶液 取約兩支注射液重量的粉末，加入6 mol/L鹽酸溶液2 mL，110℃加熱24 h，水解完成后水浴蒸去鹽酸，加入內(nèi)標(biāo)溶液250 μL 后，加水至5 mL。

2.3 衍生化方法

將上述溶液用0.45 μm濾膜濾過(guò)，精密吸取續(xù)濾液10 μL，置6 mm ×50 mm樣品管中，精密加入AccQ·Fluor中的硼酸緩沖液(Buffer 1)70 μL，渦旋混勻，立即精密加入衍生化試劑20 μL，渦旋反應(yīng)30 s，用封口膜密封樣品管，室溫放置1 min，于55℃加熱20 min，即得。

2.4 線性與檢出限

分別取混合儲(chǔ)備液和新制備的Gln、Asn和Trp對(duì)照品溶液適量，加入內(nèi)標(biāo)溶液適量，制成各種氨基酸濃度均約為 0.005，0.01，0.02，0.05，0.10，0.25，0.50 mmol/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。按2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生化，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以各種氨基酸峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)Y，各氨基酸濃度(換算成mg/L)為橫坐標(biāo)X，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，21種氨基酸在0.50～0.005 mmol/L范圍內(nèi)與峰面積比具有良好的線性關(guān)系。將標(biāo)準(zhǔn)混合溶液逐步稀釋后以S/N=3確定檢出限，得到21種氨基酸的檢出限均小于1.57 ng(表2)。

2.5 重復(fù)性及穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，進(jìn)行衍生化反應(yīng)和色譜分析，分別在0，2，4，8，12 和 24 h 進(jìn)樣，根據(jù)各氨基酸色譜峰峰面積與內(nèi)標(biāo)峰峰面積比值，計(jì)算RSD，以考察樣品溶液的穩(wěn)定性，21種氨基酸穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD均小于4.50%。另取同一批胎盤多肽注射液6份，進(jìn)行衍生化反應(yīng)和色譜測(cè)定，根據(jù)各種氨基酸的色譜峰峰面積與內(nèi)標(biāo)峰峰面積比值，計(jì)算RSD，以考察方法的重復(fù)性，21種氨基酸峰重復(fù)性試驗(yàn)RSD均小于4.15%(n=6)。

表2 21種氨基酸的線性方程及檢出限Tab.2 Regression equations and LOD of 21 amino acids

2.6 回收率試驗(yàn)

取已知含量的供試品，平行6份，精密稱定，分別精密加入0.10 mmol/L氨基酸對(duì)照溶液0.50 mL，進(jìn)行衍生化反應(yīng)并測(cè)定含量，計(jì)算各種氨基酸的加樣回收率，結(jié)果見表3，平均回收率在82.8% ～112.8%，RSD在1.70% ～14.0%。

2.7 游離氨基酸的測(cè)定結(jié)果

取三批游離氨基酸供試品溶液各兩份，進(jìn)行衍生化反應(yīng)，分別取5 μL，注入色譜儀，進(jìn)行測(cè)定，得到游離氨基酸的色譜圖(圖1B)，測(cè)定結(jié)果見表4。

2.8 水解總氨基酸的測(cè)定結(jié)果

取三批水解氨基酸供試品溶液各兩份，進(jìn)行衍生化反應(yīng)，分別取5 μL，注入色譜儀，進(jìn)行測(cè)定，得到水解后氨基酸的色譜圖(圖1C)，測(cè)定結(jié)果見表5。

3 討論

酰胺類氨基酸的檢測(cè)歷來(lái)是分析的難點(diǎn)［4］，本法在經(jīng)典的AQC衍生化氨基酸分析方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，只需精確控制緩沖液的pH值即可。在色譜分離過(guò)程中有三個(gè)關(guān)鍵色譜峰對(duì)，其中Glu和Asn峰對(duì)對(duì)pH變化很敏感，當(dāng)pH值由5.00改變?yōu)?.10時(shí)，Glu和Asn峰對(duì)由相互重疊逐漸達(dá)到完全分離，而His和Gly、NH3和Ala峰對(duì)的分離略受影響;同時(shí)NH3和Ala峰對(duì)有機(jī)相比例變化較敏感，通過(guò)試驗(yàn)將有機(jī)相組成確定乙腈-水(57∶43)。這三組峰對(duì)的保留時(shí)間均比較小，先以較小流速洗脫再增加流速，可進(jìn)一步改善分離效果，使三組峰對(duì)均能達(dá)到基本分離。

表3 21種氨基酸的加樣回收率(n=6)Tab.3 Recoveries of 21 amino acids added(n=6)

表4 游離氨基酸的測(cè)定結(jié)果Tab.4 Results of determination of free amino acids

表5 水解總氨基酸的測(cè)定結(jié)果Tab.5 Results of determination of total amino acids after hydrolysis

氨基酸測(cè)定結(jié)果表明，胎盤多肽注射液的游離氨基酸和水解氨基酸含量非常接近，僅個(gè)別氨基酸水解后含量略有增加，根據(jù)計(jì)算可以大致推斷，胎盤多肽注射液中的多肽含量為4～20 μg/mL。此含量低于文獻(xiàn)報(bào)道的50 μg/mL［5］，可能是由于取樣量太少導(dǎo)致的誤差，也有可能是不同批次生產(chǎn)工藝的差別導(dǎo)致的。為了深入探究其原因，將這3批胎盤多肽注射液分別用福林酚法和雙辛可寧酸(BCA)法［5］進(jìn)行測(cè)定，得到其多肽的含量約為 50 μg/mL。為了驗(yàn)證胎盤多肽注射液中的游離氨基酸是否對(duì)比色法的結(jié)果有干擾，依照AQC法測(cè)定的游離氨基酸含量自行配制了一份氨基酸混合對(duì)照品溶液，也采用福林酚法和BCA法進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)該氨基酸混合對(duì)照品溶液的吸光度值約均占總吸光度值的30%左右，故樣品中的游離氨基酸對(duì)比色法的測(cè)定結(jié)果有干擾。又由于胎盤多肽注射液是由胎盤提取液制得，成分較復(fù)雜，其中很可能還有其他物質(zhì)對(duì)比色法的測(cè)定結(jié)果有干擾。故比色法的專屬性不強(qiáng)，多肽的含量用AQC法衍生高效液相色譜法測(cè)定比較合理。

［1］ 楊桂琴，鄒興淮.胎盤及其提取物的化學(xué)成分、藥理作用及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，34(2):150-154.

［2］ 陳柏林，郭 敏，陳莉娟.HPLC Pico-Tag法分析人胎盤的氨基酸成分［J］.營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，1996，18(4):480-482.

［3］ 李東浩，姚艷紅.胎盤注射液中氨基酸的GC/MS測(cè)定［J］.延邊大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，1995，21(3):25-28.

［4］ Van Wandlen C，Cohen S A.Using quaternary high-performance liquid chromatography eluent systems for separating 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate-derivatized amino acid mixtures［J］.J Chromatogr A，1997，763:11-15.

［5］ 張?jiān)瞥o(jì) 宇.雙辛可寧酸法測(cè)定胎盤多肽注射液中低濃度多肽的含量［J］.中國(guó)生化藥物雜志，2010，31(6):402-404.