翟鳳馨，鄭石磊

(遼寧醫(yī)學(xué)院 附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121001)

近年來(lái)，隨著人們對(duì)熱療治療腫瘤機(jī)理研究的不斷深入，熱作用對(duì)腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能和生長(zhǎng)代謝的影響得到肯定。臨床上一般認(rèn)為，腫瘤局部組織加熱到43℃并持續(xù)一定時(shí)間即可獲得滿意療效［1-2］。熱作用可使腫瘤細(xì)胞壞死，并誘發(fā)其凋亡［3］，同時(shí)可提高機(jī)體免疫力，對(duì)防止腫瘤轉(zhuǎn)移起到積極作用［4］。經(jīng)導(dǎo)管肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)(Trancatheter arterial chemoembolization，TACE)是非手術(shù)治療肝癌的首選方法，TACE聯(lián)合其他藥物和療法治療肝癌已有一定的研究[5-6]，然而，TACE結(jié)合熱療治療相關(guān)研究較少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)熱療聯(lián)合TACE治療兔VX2肝種植瘤模型，探討其對(duì)VX2腫瘤生長(zhǎng)、血管生成的影響。

1 材料

超液態(tài)碘化油，法國(guó)Guerbet公司;鹽酸阿霉素，浙江海正藥業(yè);碘普羅胺，德國(guó)拜耳公司;CD34、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)抗體和即用型SABC免疫組化染色試劑盒，北京博奧森公司;VX2瘤株由本院放射線科雷震教授惠贈(zèng)。

Siemens Definition AS+128層 CT機(jī);Siemens AX10-M Artis dTA DSA;SR-1000深部射頻熱療機(jī)(深圳先科醫(yī)療公司);CIAS-1000型細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)(北京恒大公司)。

日本大耳白兔，雌雄不限，體重2.6～3.1 kg，平均2.9 kg，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):SCXK(遼)2009-0004。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型制備及分組

將VX2組織塊剪碎制成懸液，注射于傳代兔后腿內(nèi)側(cè)肌肉，14 d后可觸及包塊，剝離生長(zhǎng)活躍的瘤組織剪成約2 mm3/塊，各實(shí)驗(yàn)兔麻醉后，開腹直視下暴露肝左葉，以5F導(dǎo)管鞘刺破肝包膜約5 mm，用其內(nèi)芯推入瘤塊3個(gè)，以明膠海綿封堵穿刺通道，縫合上腹切口。VX2荷瘤兔40只隨機(jī)分為對(duì)照組(A組)、碘油組(B組)、熱療組(C組)、阿霉素加碘油組(D組)、熱療聯(lián)合阿霉素加碘油組(E組)，每組8只。

2.2 治療

腫瘤植入后14 d進(jìn)行治療，3F-SP微導(dǎo)管經(jīng)兔股動(dòng)脈插至腹腔動(dòng)脈，手推60%碘普羅胺5 mL行腹腔動(dòng)脈造影，超選擇至肝左動(dòng)脈并進(jìn)行相應(yīng)治療。A組:經(jīng)導(dǎo)管緩慢注入生理鹽水10 mL;B組:超液態(tài)碘化油0.3 mL/kg經(jīng)導(dǎo)管緩慢注入，術(shù)中嚴(yán)密觀察碘油沉積情況;C組:單純熱療，熱療機(jī)頻率40.7 MHz，電容式加熱，極板直徑15和20 cm，治療功率800～1 000 W，調(diào)節(jié)匹配控制在3%以下，測(cè)溫系統(tǒng)由高阻線測(cè)溫傳感器和計(jì)算機(jī)組成，精確度為±0.1℃，治療時(shí)間30 min;D組:超液態(tài)碘化油0.3 mL/kg與阿霉素2 mg/kg采用“泵法”反復(fù)混合后制成乳劑，經(jīng)導(dǎo)管緩慢注入;E組:超液態(tài)碘化油0.3 mL/kg與阿霉素混合乳劑2 mg/Kg栓塞后按C組方法行熱療，治療時(shí)間亦為30 min。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 腫瘤體積及生長(zhǎng)率 腫瘤植入后14及21 d參照何東風(fēng)等［7］報(bào)道的方法行CT掃描。計(jì)算腫瘤體積及生長(zhǎng)率。腫瘤的體積(V)=(1/2)ab2，其中a為最大徑，b為最小徑;腫瘤生長(zhǎng)率=(V治療后/V治療前-1)×100%。

2.3.2 血清ALT、AST水平 腫瘤植入前、植入后14 d及治療后7 d耳緣靜脈取血3 mL，分離血清并于-20℃保存，采用Olympus AU2700全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清ALT、AST水平。

2.3.3 微血管密度(MVD)、VEGF免疫組化檢測(cè)

MVD計(jì)數(shù)采用Weidner報(bào)告的方法［8］，低倍鏡下選擇血管熱點(diǎn)區(qū)后在高倍鏡下計(jì)數(shù)3個(gè)視野的棕染血管數(shù)，取均值作為MVD值;VEGF表達(dá)參照吳文娟等［9］報(bào)道的方法采用吸光度值表示，每張切片選取5個(gè)視野計(jì)算得出平均吸光度值。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS16.0軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料采用(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析;MVD計(jì)數(shù)與VEGF表達(dá)采用雙變量相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組實(shí)驗(yàn)兔體重、腫瘤體積及生長(zhǎng)率

結(jié)果見(jiàn)表1。治療前各組兔體重?zé)o顯著差異;治療后各組兔體重均略有下降，但與治療前比較均無(wú)顯著差異，各組間比較差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與A組比較，各組治療后腫瘤體積及生長(zhǎng)率均受到不同程度抑制，E組腫瘤體積及生長(zhǎng)率最小，與其他各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各組兔的體質(zhì)量、腫瘤體積及生長(zhǎng)率測(cè)定結(jié)果(n=8，±s)

表1 各組兔的體質(zhì)量、腫瘤體積及生長(zhǎng)率測(cè)定結(jié)果(n=8，±s)

與A組比較:1P＜0.05;與B、C、D組比較:2P＜0.05

組 別 體重/(kg)治療前 治療后腫瘤體積/(cm3)治療前 治療后 生長(zhǎng)率/%A組 2.89±0.21 2.82±0.22 1.25±0.25 3.64±0.55 339.3±76.6 B組 2.83±0.22 2.71±0.19 1.27±0.27 2.53±0.411 218.4±43.91 C組 2.90±0.24 2.81±0.20 1.30±0.29 2.32±0.401 195.5±40.61 D組 2.83±0.23 2.67±0.22 1.32±0.32 2.26±0.341 189.8±36.91 E 組 2.86 ±0.20 2.76±0.19 1.28 ±0.28 1.59±0.321，2 118.7±21.31，2

3.2 血清AST、ALT水平

結(jié)果見(jiàn)表2。第1天(種植前)各組兔ALT、AST差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第14天ALT及AST均升高，各組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第21天，各栓塞治療組(B、D、E組)ALT、AST升高幅度明顯大于 A、C組;B、D、E三組間ALT、AST比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;三個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組兔ALT、AST呈升高趨勢(shì)，組內(nèi)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 各組兔血清ALT、AST測(cè)定結(jié)果(n=8，±s)

表2 各組兔血清ALT、AST測(cè)定結(jié)果(n=8，±s)

與1 d比較:1P＜0.05;與14 d比較:2P＜0.05;與A組比較:3P＜0.05

組 別 ALT(u/L)1 d 14 d 21 d AST(u/L)1 d 14 d 21 d A 組 39.7±4.3 76.7±14.21 96.7±14.81，2 26.7±4.5 76.5±14.01 113.5±13.51，2 B 組 37.3 ± 3.9 74.5 ± 12.21 261.4 ± 26.31，2，3 27.4 ± 4.7 75.5 ± 15.91 305.5 ± 24.71，2，3 C 組 38.7 ± 4.0 73.7 ± 11.61 189.3 ± 20.41，2，3 28.4 ± 4.9 74.4 ± 17.51 196.6 ± 18.71，2，3 D 組 36.7 ± 2.4 77.7 ± 15.21 281.6 ± 26.31，2，3 25.7 ± 4.1 74.4 ± 16.51 318.5 ± 30.61，2，3 E 組 37.3 ±4.1 78.5 ±16.21 265.7 ±24.41，2，3 26.4 ±4.4 73.5 ±13.31 312.7 ±32.31，2，3

3.3 殘存腫瘤區(qū)MVD、VEGF表達(dá)

結(jié)果見(jiàn)圖1～2和表3。腫瘤組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞膜CD34陽(yáng)性表達(dá)為棕黃染色，表達(dá)的腫瘤微血管分布不均，其中E組MVD計(jì)數(shù)最少，與其他各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;VEGF呈彌漫性或集中表達(dá)于幾個(gè)瘤巢中，VEGF陽(yáng)性表達(dá)為胞漿、胞核棕黃染色，在靠近腫瘤邊緣區(qū)域及癌巢中表達(dá)較強(qiáng)，B、D組VEGF表達(dá)強(qiáng)度最強(qiáng)，E組VEGF表達(dá)最弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MVD與VEGF表達(dá)強(qiáng)度之間呈正相關(guān)。

圖1 阿霉素加碘油組(A)、熱療聯(lián)合阿霉素加碘油組(B)CD34染色(×100)

圖2 阿霉素加碘油組(A)、熱療聯(lián)合阿霉素加碘油組(B)VEGF染色(×400)

4 討論

熱療對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的直接殺傷能力，而且還可以增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性并促進(jìn)其凋亡，能使化療藥更有效地滲透進(jìn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)，促進(jìn)化療藥物與腫瘤細(xì)胞結(jié)合，與化療藥物具有一定的協(xié)同作用，而且在化療藥物用量固定的情況下提高其滅活腫瘤細(xì)胞的作用［10］。Liang等［11］報(bào)道熱療可以通過(guò)改變凋亡基因p53、Bcl-2和Bax的表達(dá)進(jìn)而提高化療的療效，促進(jìn)腫瘤凋亡。TACE是目前非手術(shù)治療肝癌的首選方法，其增加了腫瘤區(qū)域的化療藥物濃度，不僅阻斷腫瘤血供，而且使藥物在腫瘤內(nèi)的停留時(shí)間延長(zhǎng)。本研究發(fā)現(xiàn)，熱療聯(lián)合TACE治療組荷瘤兔，其腫瘤體積及生長(zhǎng)率均低于其他各組，熱療提高了腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性，說(shuō)明熱療與栓塞化療產(chǎn)生了一定的協(xié)同作用，其作用機(jī)制可能與抑制多耐藥基因的表達(dá)有關(guān)［12］，抑制腫瘤生長(zhǎng)的效果優(yōu)于單純TACE組、熱療組及碘油組。

表3 治療后1周各組實(shí)驗(yàn)兔腫瘤MVD及VEGF的表達(dá)(n=8，±s)

表3 治療后1周各組實(shí)驗(yàn)兔腫瘤MVD及VEGF的表達(dá)(n=8，±s)

與A組比較:1P＜0.05;與B、C、D組比較:2P＜0.05

組 別 MVD VEGF表達(dá)強(qiáng)度 r值 P值A(chǔ)組22.5±3.8 0.147±0.020 0.889 0.003 B組 23.9±4.0 0.169±0.0241 0.824 0.013 C組 21.2±4.2 0.146±0.018 0.831 0.013 D組 25.4±4.8 0.166±0.0231 0.861 0.006 E 組 16.8 ± 3.61，2 0.122 ± 0.0171，20.812 0.016

通常，肝組織受損傷最常用的指標(biāo)主要包括ALT和AST，二者的升高主要提示存在急性肝損傷。本實(shí)驗(yàn)中使用血清AST、ALT水平來(lái)評(píng)價(jià)各治療組實(shí)驗(yàn)兔的肝功損害程度。結(jié)果表明，腫瘤植入后1，14及21 d各組實(shí)驗(yàn)兔AST、ALT呈逐漸升高趨勢(shì)，治療后與對(duì)照組相比，各治療組均對(duì)肝功能有一定的損害，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。這與高建華等［13］的研究結(jié)果相符，說(shuō)明熱療不會(huì)加重TACE治療對(duì)肝組織的損害。臨床上肝癌患者常伴有較重的肝硬化病史，肝功能往往均受到一定影響，而熱療聯(lián)合TACE治療不會(huì)加重肝損害，因此，熱療聯(lián)合TACE治療是可行的。

在腫瘤浸潤(rùn)、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，血管生成越來(lái)越受到重視，其中MVD與VEGF是腫瘤血管生成的最主要因素，因此，VEGF也成為許多藥物治療的靶點(diǎn)。在熱療后，腫瘤細(xì)胞中的VEGF基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成明顯受到抑制，血清VEGF水平明顯降低［14］。因而提示熱療可用于防止腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，其抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的機(jī)制可能與抑制VEGF表達(dá)降低MVD有關(guān)。本研究各組兔治療后7 d取材，免疫組化檢測(cè)MVD和VEGF結(jié)果表明熱療聯(lián)合TACE組的MVD和VEGF與其他三組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，表現(xiàn)為熱療聯(lián)合TACE治療組均值最低，TACE組均值略高于對(duì)照組，該結(jié)果與Sawaji等［14］的結(jié)論相符。另外，碘油具有受熱后黏滯度下降等物理特性，在TACE術(shù)后腫瘤組織局部加溫，使病灶部位沉積的碘油黏度下降，增強(qiáng)了其在腫瘤組織中的填充程度和對(duì)腫瘤交通支的栓塞，更有利于栓塞趨于完全，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤缺血、壞死。熱療聯(lián)合TACE治療后，殘存腫瘤區(qū)MVD、VEGF表達(dá)均在一定程度上降低，說(shuō)明該治療產(chǎn)生了一定的抗血管生成作用。阿霉素碘油組治療后殘存腫瘤區(qū)MVD及VEGF表達(dá)甚至略高于生理鹽水組，表明其對(duì)腫瘤血管生成無(wú)明顯抑制作用，原因可能在于由于栓塞導(dǎo)致腫瘤內(nèi)部缺氧，缺氧是誘導(dǎo)VEGF表達(dá)的最主要因素，同時(shí)低氧誘導(dǎo)因子-1等調(diào)節(jié)對(duì)血管生成起中心作用的VEGF基因轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn) VEGF表達(dá)，進(jìn)而引起肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移［15］。

綜上所述，熱療聯(lián)合TACE治療對(duì)于腫瘤的生長(zhǎng)及血管生成具有較明顯的抑制作用，且不會(huì)加重肝功能損害。但是熱療與TACE聯(lián)合治療肝癌的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。隨著對(duì)熱療與介入技術(shù)研究的不斷深入，熱療與TACE聯(lián)合治療肝癌及其他腫瘤方面具有廣闊前景。

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