程晶晶，潘斯科，鐘云平，張涵銘，王 馳，余 帥，于 威，李 司

(浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)研究所，浙江省家蠶生物反應(yīng)器和生物醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州310018)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)最顯著的神經(jīng)病理學(xué)特征是老年斑。老年斑主要由β淀粉樣蛋白(Aβ)42的聚集而形成。若能有效抑制Aβ42寡聚體的生成或者加速它的清除，則能有效治療AD癥狀，改善認(rèn)知功能。采用主動的Aβ免疫療法，即通過抗Aβ的抗體降低腦組織內(nèi)Aβ肽的水平，是AD預(yù)防和治療的有效策略［1-3］。CTB(霍亂毒素B亞單位)是一種良好的免疫佐劑和輸送抗原載體，將其與目的抗原偶聯(lián)成融合蛋白后可增強(qiáng)其佐劑和載體作用 。

本研究將 CTB-Aβ42融合蛋白在大腸桿菌pGEX-4T-1表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，探索得可溶性表達(dá)和胞內(nèi)表達(dá)的最適條件，純化得融合蛋白，為Aβ疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料

原核表達(dá)載體pGEX-4T-1、大腸桿菌(Escherichia Coli)表達(dá)菌株BL21由浙江理工大學(xué)生化所保存;兔抗CTB抗體購自Sigma公司;過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購自北京鼎國公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、還原型谷胱甘肽(GSH)、Glutathione Sepharose 4B親和色譜柱，Aersham公司;聚偏氟乙烯膜(PVDF)，Millipore公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1600凝膠成像系統(tǒng)，Tanon公司;EPS601二維電泳儀，Amersham公司;SCIENTZ-ⅡD超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司;Neofuge 13R臺式高速冷凍離心機(jī)，Heal Force公司;himac CR 21G大型高速冷凍離心機(jī)，HITACHI公司。

2 方法

2.1 誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化及表達(dá)產(chǎn)物的SDSPAGE分析

將構(gòu)建好的表達(dá)菌株37℃培養(yǎng)4 h，新鮮菌按1∶100 接種，不同溫度(25，30，37，42 ℃)條件下培養(yǎng)，分別加入不同濃度的 IPTG(0.1，0.2，0.5，1.0 mmol/L)，并誘導(dǎo)不同時(shí)間(1，2，3，4，5，6 h)，12 000 r/min離心15 min，收集菌體，每20 mL原始菌液以磷酸鹽緩沖液(PBS)1 mL重懸，冰上超聲裂解，超聲條件:超聲5 s，停5 s。12 000 r/min離心20 min，分別收集上清和沉淀，通過SDS-PAGE［7］檢測目的基因的表達(dá)情況。12%分離膠和5%濃縮膠，電泳結(jié)束后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)R-250染色，并用凝膠成像系統(tǒng)成像掃描分析。

2.2 融合蛋白的純化和復(fù)性

2.2.1 融合蛋白的洗滌 菌液6 000 r/min離心15 min，收集沉淀，去離子水洗滌，重懸后，6 000 r/min離心15 min;取沉淀稱重，每1 g濕菌用裂解緩沖液(100 mmol/L NaCl，8 mmol/L EDTA，50 mmol/L Tris，pH 8.0)9 mL重懸，室溫下?lián)u床30 min;超聲裂解15 min，超聲條件:超5 s，停5 s。12 000 r/min 離心15 min，所得沉淀重懸于9倍體積包涵體洗滌液Ⅰ(5 mmol/L EDTA，1%Triton-X-100，20 mmol/L Tris，pH 8.0)，室溫放置 10 min，12 000 r/min 離心10 min，洗滌3次，再用包涵體洗滌液Ⅱ(5 mmol/L EDTA，4 mol/L 尿素，20 mmol/L Tris，pH 8.0)洗滌3次，收集沉淀。

2.2.2 融合蛋白的溶解 洗滌后的沉淀每1 L原始菌液加入溶解液(8 mol/L尿素，5 mmol/L EDTA，100 mmol/L β-巰基乙醇;20 mmol/L Tris，pH 8.0)30 mL，室溫?cái)嚢?0 min至液體澄清;12 000 r/min離心10 min，收集上清。

2.2.3 融合蛋白的超濾復(fù)性 超濾管裝適量上清，6 000 r/min離心7 min，加PBS重懸，收集樣品。

2.2.4 融合蛋白的分離純化 將收集的上清上樣，經(jīng)pH 7.3 PBS預(yù)平衡的Glutathione Sepharose 4B親和色譜柱，流速1 mL/min，收集洗脫液500 μL，重復(fù)3次。用5倍柱體積的pH 7.3 PBS充分洗滌后，用50 mmol/mL Tris-HCl緩沖液(pH 8.0，含10 mmol/L GSH)20 mL洗脫柱上結(jié)合的GST-CTB-Aβ42融合蛋白，并收集洗脫液500 μL，重復(fù)2次，SDS-PAGE凝膠電泳檢測。

2.3 表達(dá)產(chǎn)物的Western blot鑒定

樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，通過干法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，放入TBS中輕輕搖動洗膜10 min;去除TBS，加封閉液(含3%BSA的PBS溶液)，37℃輕搖2 h;再用含兔抗CTB抗體(1∶2 000稀釋)37℃ 1.5 h;TBST洗膜3次，每次5 min，加入山羊抗兔 IgG(用TBST以1∶1 000稀釋)，室溫下緩搖1 h后，先TBST洗膜3次，每次10 min，再TBS洗膜2次，每次5 min;將膜轉(zhuǎn)入DAB顯色液中，室溫暗處顯色5 min，待有明顯條帶出現(xiàn)時(shí)用去離子水漂洗終止反應(yīng)。

3 結(jié)果

3.1 誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化及表達(dá)產(chǎn)物的SDSPAGE分析

可溶性表達(dá)的最適誘導(dǎo)表達(dá)條件為30℃，0.1 mmol/L IPTG，誘導(dǎo)2 h。30℃誘導(dǎo)的上清中融合蛋白表達(dá)量明顯高于25和37℃中的蛋白表達(dá)量(圖1)。30℃時(shí)在各IPTG濃度下誘導(dǎo)表達(dá)，0.1 mmol/L時(shí)融合蛋白的表達(dá)量最高(圖2)。30℃，以0.1 mmol/L誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)間為2 h時(shí)，表達(dá)量最高(圖3)。

胞內(nèi)表達(dá)的最適誘導(dǎo)表達(dá)條件為37℃，0.1 mmol/L IPTG，誘導(dǎo)4 h。37℃條件下融合蛋白以包涵體形式胞內(nèi)表達(dá)量較25和42℃時(shí)多60%(圖4)。37℃時(shí)在各IPTG濃度下誘導(dǎo)表達(dá)，0.1 mmol/L時(shí)融合蛋白的表達(dá)量最高(圖5)。37℃，以0.1 mmol/L誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時(shí)間為4 h時(shí)，表達(dá)量最高(圖6)。

3.2 融合蛋白的純化和復(fù)性

3.2.1 上清中融合蛋白的純化 洗脫的主要蛋白條帶分子質(zhì)量約為45 kD，與GST-CTB-Aβ42融合蛋白的預(yù)測分子質(zhì)量一致(圖7)。

圖1 不同誘導(dǎo)溫度對GST-CTB-Aβ42融合蛋白在上清表達(dá)的影響Fig.1 Effects of different induction temperatures on soluble expression of GST-CTB-Aβ42

圖2 不同IPTG濃度對GST-CTB-Aβ42融合蛋白在上清表達(dá)的影響Fig.2 Effects of different IPTG concentrations on soluble expression of GST-CTB-Aβ42

圖3 不同誘導(dǎo)時(shí)間對GST-CTB-Aβ42融合蛋白在上清表達(dá)的影響Fig.3 Effects of different induction durations on soluble expression of GST-CTB-Aβ42

圖4 不同誘導(dǎo)溫度對GST-CTB-Aβ42融合蛋白胞內(nèi)表達(dá)的影響Fig.4 Effects of different induction temperatures on intracellular expression of GST-CTB-Aβ42

圖5 不同IPTG濃度對GST-CTB-Aβ42融合蛋白胞內(nèi)表達(dá)的影響Fig.5 Effects of different IPTG concentrations on intracellular expression of GST-CTB-Aβ42

圖6 不同誘導(dǎo)時(shí)間對GST-CTB-Aβ42融合蛋白胞內(nèi)表達(dá)的影響Fig.6 Effects of different induction durations on intracellular expression of GST-CTB-Aβ42

圖7 SDS-PAGE分析上清中的融合蛋白的純化Fig.7 SDS-PAGE analysis of purification of fusion protein in soluble expression

3.2.2 包涵體的純化和超濾復(fù)性 粗制包涵體和精制包涵體蛋白的條帶分子質(zhì)量約為45 kD，與預(yù)期一致(圖8)。

圖8 SDS-PAGE分析包涵體融合蛋白的純化Fig.8 SDS-PAGE analysis of purification of fusion protein in intracellular expression

3.3 表達(dá)產(chǎn)物的Western blot鑒定

將純化所得融合蛋白進(jìn)行Western blot鑒定，蛋白條帶分子質(zhì)量約為45 kD，與抗CTB抗體發(fā)生特異性反應(yīng)(圖9)。

4 討論

外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)受到很多因素的影響，如載體與宿主菌、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)和誘導(dǎo)劑用量，培養(yǎng)基成分等［8］。而且大腸桿菌中缺乏真核生物翻譯后修飾蛋白所需的酶類和輔助因子，如折疊酶或分子伴侶等，致使中間產(chǎn)物大量聚集，從而形成包涵體［9］。

圖9 GST-CTB-Aβ42融合蛋白的Western blot分析Fig.9 Western blot analysis of GST-CTB-Aβ42 fusion protein

誘導(dǎo)溫度是融合蛋白表達(dá)的重要因素，最適合大腸桿菌生長的溫度為37～42℃，在此溫度下表達(dá)外源蛋白極易生產(chǎn)包涵體，低溫培養(yǎng)條件下表達(dá)外源蛋白能有效地增加可溶蛋白的比例［10］。本實(shí)驗(yàn)中，37℃誘導(dǎo)，分泌表達(dá)少，但表達(dá)總量很多;降低溫度至25℃誘導(dǎo)，表達(dá)總量少，但分泌表達(dá)所占比例最高;選取30℃誘導(dǎo)，對優(yōu)化蛋白表達(dá)體系有重要作用。

IPTG是β-半乳糖苷酶的活性誘導(dǎo)物質(zhì)，它誘導(dǎo)條件簡單，效率高，并且不被大腸桿菌所代謝，是一種有效的乳糖操縱子的誘導(dǎo)劑，可與阻遏物結(jié)合促進(jìn)基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中，探索可溶性表達(dá)最佳條件時(shí)發(fā)現(xiàn)，以0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)與1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)效果相似，由于IPTG本身有毒性，價(jià)格昂貴，因此選取0.1 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。

本實(shí)驗(yàn)表明，在30℃，0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h，蛋白的可溶性表達(dá)量最高;在37℃，0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h，蛋白的總表達(dá)量最高，但由于融合蛋白本身易聚集形成包涵體，可溶性表達(dá)的蛋白比例不高。

由于包涵體中的融合蛋白與部分破碎的細(xì)胞膜、膜蛋白及脂體粘連在一起，所以在溶解包涵體之前要先洗滌包涵體，通常用低濃度的變性劑如2 mmol/L尿素在 50 mmol/L Tris(pH 7.0～8.5)，1 mol/L EDTA中洗滌［11］。通過洗滌包涵體沉淀得到粗制的融合蛋白，高濃度的變性劑能使包涵體溶解，如6 mol/L的鹽酸胍或8 mol/L的尿素，通過離子間的相互作用，破壞包涵體蛋白間的氫鍵而使大部分包涵體蛋白溶解。為獲得有生物活性的蛋白，需將溶解后的蛋白進(jìn)行復(fù)性，傳統(tǒng)的復(fù)性方法有稀釋、透析和超濾復(fù)性［12］。超濾復(fù)性是選擇合適載留分子質(zhì)量的膜，允許變性劑通過膜而蛋白質(zhì)通不過，達(dá)到除去高濃度尿素的效果。本實(shí)驗(yàn)用8 mol/L尿素處理包涵體，超濾后用GST柱進(jìn)行純化，得到了GST-CTB-Aβ42融合蛋白。這為Aβ疫苗的研究提供了充分的實(shí)驗(yàn)條件，有利于Aβ的主動免疫治療的深入研究和探索，也為具有更強(qiáng)免疫原性的Aβ疫苗的制備工藝提供了一種新思路。

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