陸 英，李佳銀，李覓路，李榮根，劉仲華，

(1.國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

紫錐菊(Echinacea)是原產(chǎn)于北美的一種松果菊屬植物，它是歐美國(guó)際市場(chǎng)需求量最大的植物藥之一［1］，廣泛用于預(yù)防和治療上呼吸道感染，減輕炎癥及愈合傷口［2］。目前在我國(guó)北京、南京、上海、長(zhǎng)沙等地引種栽培成功，對(duì)引種紫錐菊的開(kāi)發(fā)利用正在興起?，F(xiàn)代研究認(rèn)為，紫錐菊的免疫作用主要依賴(lài)于咖啡酸類(lèi)衍生物、烷基酰胺類(lèi)化合物及多糖［3］。紫錐菊根正已烷提取物(多為烷基酰胺類(lèi)化合物)體外、體內(nèi)都具有免疫［4-5］及抗腫瘤活性［6-7］，該類(lèi)成分更易透過(guò)小腸壁被吸收而發(fā)揮作用［8］，然而其作用機(jī)理尚不清楚。

紫錐菊烷基酰胺類(lèi)化合物多為一系列含烯、炔鍵且結(jié)構(gòu)相似的同分異構(gòu)或同系物，在紫錐菊地上部分含量很低，根中含量稍高［9］，分離困難。前人主要通過(guò)多次硅膠柱色譜并與薄層色譜、制備液相等方法聯(lián)用分離得到［10-11］，存在操作繁瑣、制備量小、重現(xiàn)性差等弊端。高速逆流色譜(HSCCC)是一種不使用固態(tài)支撐體或載體的液液分配色譜技術(shù)，避免了固態(tài)載體對(duì)分離樣品的不可逆吸附，具有高回收率。本實(shí)驗(yàn)利用HSCCC與制備HPLC聯(lián)用技術(shù)，建立了簡(jiǎn)便、快捷、穩(wěn)定的紫錐菊烷基酰胺類(lèi)化合物的制備方法，為紫錐菊制品的質(zhì)量控制及進(jìn)一步的藥理藥效研究提供重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料

紫錐菊根購(gòu)于湖南瀏陽(yáng)生物園工業(yè)園紫錐菊種植基地。

甲醇、乙腈為色譜純;石油醚、正己烷、甲醇等為分析純。

TBE-300A型高速逆流色譜儀(配有 TBD-2000UV紫外監(jiān)測(cè)儀)，上海同田生化技術(shù)有限公司;LC-20AT分析高效液相色譜儀(配有SPD-M20A檢測(cè)器)、LC-10A制備高效液相色譜儀及TRC-ODS C18色譜柱，日本島津公司;R-1001型真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州長(zhǎng)城工貿(mào)有限公司;Agilent 1100 Series LC/MSD質(zhì)譜儀，美國(guó)安捷倫公司;瓦里安INOVA-300核磁共振儀，美國(guó)瓦里安公司。

2 方法

2.1 HSCCC進(jìn)樣原料的準(zhǔn)備

當(dāng)年生紫錐菊根7月下旬采收，洗凈，切成小片，60℃干燥，取200 g用8倍60%乙醇50℃回流提取3次，合并濾液，50℃減壓濃縮至無(wú)醇味(約500 mL)，用等體積石油醚萃取3次，萃取液回收石油醚，得浸膏狀物質(zhì)置冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 HSCCC溶劑體系的選擇

實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定分配系數(shù)(K)來(lái)選擇兩相溶劑體系:取少量浸膏用已平衡的兩相溶劑體系的下相溶解，取20 μL經(jīng)HPLC檢測(cè)，峰面積為A1;然后將等體積的上相加入到該下相中，充分混合，待兩相完全平衡后，取下相20 μL再次經(jīng)HPLC檢測(cè)，峰面積為A2，K=(A1-A2)/A2。

2.3 兩相溶劑體系的準(zhǔn)備及分離過(guò)程

按正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(2∶5∶5∶3)配制溶劑體系，充分混合后靜置過(guò)夜，再將上相與下相分離，分別裝入試劑瓶里，超聲脫氣20 min;將上相以20 mL/min的流速泵入HSCCC儀管柱中，使之充滿管住作為固定相，調(diào)整儀器溫度為25℃，以正轉(zhuǎn)800 r/min的速度穩(wěn)定運(yùn)行，用下相作流動(dòng)相以2.0 mL/mim的流速泵入管柱;當(dāng)流動(dòng)相流出時(shí)，說(shuō)明管柱中兩相已平衡，此時(shí)將樣品溶液(樣品200 mg溶解在上下相的混合液15 mL中)從進(jìn)樣口注入。進(jìn)樣1 h后進(jìn)行圖譜采集，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，收集流分1～8，合并后減壓濃縮至干。

2.4 制備HPLC分離及結(jié)晶

將2.3項(xiàng)下制得的各流分混合物用少量二甲亞砜溶解，在制備型HPLC儀上進(jìn)行制備分離，進(jìn)樣量1 mL，用36%乙腈等梯度洗脫，流速15 mL/min，根據(jù)峰形分別接收各組分，真空旋轉(zhuǎn)濃縮至干后加少量乙腈-水(1∶1)于4℃冰箱結(jié)晶3～7 d，得各單體組分結(jié)晶。

2.5 分析型HPLC條件及結(jié)構(gòu)鑒定

分析型HPLC條件為:WondaSilTM C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，46%乙腈溶液等梯度洗脫，流速l.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫35℃。采用面積歸一法計(jì)算樣品純度。所得化合物通過(guò)MS、1HNMR、13CNMR等技術(shù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

3 結(jié)果與討論

3.1 HSCCC上樣原料的制備

文獻(xiàn)資料多采用甲醇和正已烷對(duì)紫錐菊烷基酰胺進(jìn)行提取，本實(shí)驗(yàn)考察了正已烷、石油醚、乙酸乙酯、甲醇及不同質(zhì)量濃度的乙醇(40%，60%，80%，95%)進(jìn)行提取的效果。結(jié)果表明，在相同提取條件下(固液比1∶8，時(shí)間1 h，溫度50 ℃，提取3次)，甲醇和60%乙醇提取效果最好，考慮到溶劑的安全性問(wèn)題，實(shí)驗(yàn)采用60%乙醇進(jìn)行提取。同時(shí)由于提取液中還含有大量極性較大的咖啡酸類(lèi)化合物，因此選用低極性溶劑對(duì)烷基酰胺類(lèi)化合物進(jìn)行萃取，實(shí)驗(yàn)表明，石油醚萃取效果最好。

3.2 分析HPLC條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)分別嘗試甲醇-水、乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)的HPLC洗脫效果，發(fā)現(xiàn)甲醇-水為流動(dòng)相時(shí)，組分7和8分離效果很差，而用乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)可獲得較好的分離效果，色譜圖見(jiàn)圖1，其中有8個(gè)組分含量較高。

圖1 紫錐菊根石油醚萃取物HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of petroleum ether extract from Ehinacea Purpurea root

3.3 HSCCC分離的效果考察

紫錐菊烷基酰胺類(lèi)化合物是一系列含烯、炔鍵且結(jié)構(gòu)相似的同分異構(gòu)或同系物，理化性質(zhì)非常接近，很難分離。實(shí)驗(yàn)對(duì)多種弱極性的溶劑體系進(jìn)行考察，通過(guò)HPLC測(cè)定K值來(lái)選擇溶劑系統(tǒng)。結(jié)果表明在多種不同溶劑體系下一些組分的K值都很接近，因此無(wú)法通過(guò)HSCCC一次分離得到多個(gè)單體成分，但可使目標(biāo)組分與其他親脂性成分分離，獲得高含量的烷基酰胺類(lèi)化合物。

實(shí)驗(yàn)最終確定正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(2∶5∶5∶3)作為HSCCC溶劑體系對(duì)紫錐菊烷基酰胺類(lèi)化合物進(jìn)行純化，8個(gè)組分的K值依次為:0.88，1.12，1.16，1.60，1.64，1.75，2.08 和 2.13。樣品經(jīng) HSCCC分離后得到4個(gè)流分，HSCCC圖譜及各流分中化合物組成見(jiàn)圖2。

圖2 紫錐菊根石油醚萃取物高速流色譜圖Fig.2 HSCCC chromatogram of Petroleum ether extraction of Echinecea Purpurea root

3.4 制備HPLC分離及純度鑒定

在不影響分離效果的條件下，較大的進(jìn)樣量有助于提高HPLC制備效率。由于儀器最大進(jìn)樣體積為1 mL，因此選擇合適的溶劑溶解樣品對(duì)制備效率至關(guān)重要。通過(guò)對(duì)多種不同極性溶劑對(duì)上述高純度烷基酰胺化合物溶解性能的考察，發(fā)現(xiàn)二甲亞砜的溶解性最佳。同時(shí)對(duì)制備洗脫條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，36%乙腈等梯度洗脫時(shí)目標(biāo)組分的分離較好，根據(jù)峰形收集得到8個(gè)組分。經(jīng)HPLC檢測(cè)(圖3)，面積歸一法計(jì)算純度分別為94.43%，96.80%，98.89%，98.22%，96.42%，98.70%，93.28% 和95.30%，各組分流出液濃縮至干后用少量50%乙腈溶解，置4℃冰箱，結(jié)晶，2～3號(hào)分別得到晶體15和8 mg，5～8號(hào)分別為9，5，8和15 mg，1 和4 號(hào)由于量太少，未能獲得結(jié)晶。

3.5 結(jié)構(gòu)鑒定

對(duì)獲得的6個(gè)化合物結(jié)晶進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，各化合物13C-NMR數(shù)據(jù)見(jiàn)表2，1H-NMR見(jiàn)表3。

圖3 8個(gè)化合物的HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of 8 compounds chemical structures

化合物2:白色片狀結(jié)晶。MS(APCI，Pos.):m/z 230［M+1］+;1H-NMR，13C-NMR分析數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9，11］相符，確認(rèn)為 Undeca-2Z，4E-diene-8，10-diynoic acid isobutylamide。

化合物 3和 5:白色片狀結(jié)晶。MS(APCI，Pos.):m/z 244［M+1］+;1H-NMR，13C-NMR 分析數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9，11］相符，確認(rèn)為 Dodeca-2E，4Z-diene-8，10-diynoic acid isobutylamide 和 Dodeca-2Z，4E-diene-8，10-diynoic acid isobutylamid。

化合物6:白色片狀結(jié)晶。MS(APCI，Pos.):m/z 258［M+1］+;1H-NMR，13C-NMR 分析數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9，11］相符，確認(rèn)為 Dodeca-2E，4Z-diene-8，10-diynoic acid 2-methylbutylamid。

化合物 7和 8:白色針狀結(jié)晶。MS(APCI，Pos.):m/z 248［M+1］+;1H-NMR，13C-NMR 分析數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11-12］相符，確認(rèn)為 Dodeca-2E，4E，8Z，10E-tetraenoic acid isobutylamide和 Dodeca-2E，4E，8Z，10Z-tetraenoic acid isobutylamide。

4 結(jié)論

與薄層色譜和硅膠柱色譜相比，HSCCC富集和純化紫錐菊烷基酰胺類(lèi)化合物具有操作簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好、制備量大等優(yōu)點(diǎn)，一次分離即可獲得高純度的烷基酰胺類(lèi)化合物，極大的提高了HPLC對(duì)單個(gè)化合物的制備效率。本實(shí)驗(yàn)采用HSCCC-HPLC聯(lián)用技術(shù)，獲得紫錐菊中8個(gè)烷基酰胺類(lèi)化合物，為進(jìn)一步進(jìn)行藥理研究及質(zhì)量控制奠定了基礎(chǔ)。

表2 化合物13C-NMR數(shù)據(jù)Tab.2 13C-NMR spectral data of alkamides from Ehinacea Purpurea root(300 MHz，CD3OD/TMS，ppm)

［1］ Chen Ying，F(xiàn)u Tong，Tao Tao，et al.Macrophage activating effects of new alkamides from the roots of Echinacea species［J］.J Nat Prod，2005，68:773-776.

［2］ Foster S.Echinacea.The cold and flu remedy［J］.Altern Complement Ther，1995(6-7):254-257.

［3］ Speroni E，Govoni P，Guizzardi S，et al.Antiinflammatory and cicatrizing activity of Echinacea pallida Nutt.root extract［J］.J Ethnopharmacol，2002，79:265-272.

［4］ Anita M，Linda B，Kerry M，et al.Echinacea alkylamides modulate induced immune responses in T-cells［J］.Fitoterapia，2008，79:53-58.

［5］ Goel V，Chang C，Slama J V，et al.Alkylamides of Echinacea Purpurea stimulate alveolar macrophage function in normal rats［J］.Int Immunopharmacol，2002，2:381-387.

［6］ Chicca A，Adinolfi B，Martinotti E，et al.Cytotoxic effects of Echinacea root hexanic extracts on human cancer cell lines［J］.Ethnopharmacology，2007，110:148-153.

［7］ Raner G M，Cornelious S，Moulick K，et al.Effects of herbal products and their constituents on human cytochrome P4502E1activity［J］.Food Chem Toxicol，2007，45:2359-2365.

［8］ Matthias A，Addison R S，Penman K G，et al.Echinacea alkamide disposition and pharmacokinetics in humans after tablet ingestion［J］.Life Sci，2005，77:2018-2029.

［9］ Perry N B，Van Klink J W，Burgess E J，et al.Alkamide levels in Echinacea Purpurea:A rapid analytical method revealing differences among roots，rhizomes，stems，leaves and flowers［J］.Planta Med，1997，63:58-62.

［10］ Bohlmann F，Hoffmann H.Further amides from Echinacea Purpurea［J］.Phytochemistry，1983，22:1173-1175.

［11］ Bauer R，Remiger P，Wagner H.Alkamides from the roots of Echinacea pupurea［J］.Phytochemistry，1988，27:2339-2342.

［12］ Yasuda I，Takeya K，Itokawa H.Structures of Amides from Asiasarum heterotropoides Maek.var.mandshuricum Maek［J］.Chem Pharm Bull，1981，29:546-566.