王紅梅，何培青，林學政＊，董永勝

（1.山東輕工業(yè)學院 食品與生物工程學院，山東 濟南250353；2.國家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島266061；3.國家海洋局 海洋生物活性物質(zhì)重點實驗室，山東 青島266061）

抑制尖刀鐮孢菌（Fusarium oxysporum）南極細菌的篩選及Psychrobactersp.P4－11－07－1的生長特性＊

王紅梅1，2，3，何培青2，3，林學政2，3＊，董永勝1

（1.山東輕工業(yè)學院 食品與生物工程學院，山東 濟南250353；2.國家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島266061；3.國家海洋局 海洋生物活性物質(zhì)重點實驗室，山東 青島266061）

以植物病原真菌尖刀鐮孢菌（Fusarium oxysporum）為指示菌，采用平板擴散法從實驗室極地微生物資源庫中篩選到12株具有明顯抑菌作用的活性菌株。分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析表明，7株活性菌株屬于假交替單胞菌（Pseudoalteromonas）、3株屬于嗜冷桿菌（Psychrobacter）、1株屬于假單胞菌（Pseudomonas）、1株屬于倫黑墨氏菌（Rheinheimera）。抑菌譜測定結(jié)果表明，不同活性菌株的抑菌譜也有所不同，12株活性菌株對尖刀鐮孢菌、辣椒疫霉（Phytophthora copsici）、大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）、瓜亡革菌（Thanatephorus cucumeris）均有一定的抑制作用，而對葡枝根霉（Rhizopus stolonifer）均沒有抑制作用；除菌株1－Z11，1－Z18，4－Z11，4－Z18，IS－010－07－1，P3－11－10－1，Z18－3外，其余5株菌株均對水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）有抑制作用。對一株具有較強抑菌活性的菌株P(guān)sychrobactersp.P4－11－07－1生長條件的研究表明，當培養(yǎng)溫度為5～30℃，培養(yǎng)基鹽度為0～45，初始pH值為5.0～11.0時，菌株P(guān)4－11－07－1均可生長并產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)，對應(yīng)抑菌活性最高的培養(yǎng)條件分別是：培養(yǎng)溫度為25℃，培養(yǎng)基鹽度為0，初始pH為7.0。

南極細菌；抑菌活性；分子鑒定；生長特性

植物病原真菌侵染及病害是限制農(nóng)作物產(chǎn)量的重要因素之一，隨著病原菌對已有抗生素耐藥性的增強以及新病害的出現(xiàn)，客觀上要求不斷開發(fā)高活性和新穎的抗生素。微生物源農(nóng)藥的研究除了強化常規(guī)資源的篩選和研發(fā)外，深遠海（極地）等極端環(huán)境特殊微生物資源及其生物活性物質(zhì)的研究與開發(fā)，在未來科技和經(jīng)濟競爭中也占據(jù)著重要地位［1］。極地具有獨特的地理、氣候與環(huán)境特征，生存于其中的微生物由于低溫、高鹽、強紫外線輻射等環(huán)境因子的脅迫，被賦予了獨特的適應(yīng)機制與代謝方式，可產(chǎn)生許多新型的抑菌活性物質(zhì)［2］。國內(nèi)外學者已利用這一特性，開展了一系列研究，主要涉及到產(chǎn)抑菌物質(zhì)活性菌株的分離、篩選及其活性產(chǎn)物的研究，如Giudice等［3］從南極海水中分離到能抑制其它南極海洋細菌（Arthrobacter和Corynebacterium）的菌株Actinobacteria；Bruntner等［4］從一株南極鏈霉菌Streptomyces griseusNTK97的代謝產(chǎn)物中分離到一種能抑制革蘭氏陽性菌的新型angucyclinon類抗生素frigocyclinone。而針對抑制植物病原菌或具殺蟲作用的菌株及活性物質(zhì)的研究也已開始，目前已從南極海洋細菌Marinomonassp.BSwl0005的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)了對植物病原真菌具有明顯抑制作用的抑菌物質(zhì)，并初步判定為胺類物質(zhì)［5］；田黎等［6］發(fā)現(xiàn)南極真菌Gliocladium catenulatumT31發(fā)酵液對小菜蛾具有殺蟲作用。

尖刀鐮胞菌（Fusarium oxysporum）是一種世界性分布的土傳植物病原真菌，其寄主范圍廣泛，可引起瓜類、香蕉、茄科、棉花、豆科及花卉等100多種植物枯萎病的發(fā)生［7］。本研究以尖刀鐮胞菌作為指示菌，對分離自南極海水、海冰及海洋沉積物等樣品中的細菌進行了抑菌活性菌株的篩選，并對其進行了分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析及抑菌譜測定；研究了培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基鹽度及初始pH值等對抑菌活性較強的活性菌株P(guān)4－11－07－1生長和產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的影響，以期為極地農(nóng)用微生物資源的深入研究和開發(fā)提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 菌 株

供試菌：南極海洋細菌，來自國家海洋局海洋生物活性物質(zhì)重點實驗室分離保存的極地微生物資源庫。

指示菌：尖刀鐮孢菌（Fusarium oxysporum）、葡枝根霉（Rhizopus stolonifer）、辣椒疫霉（Phytophthora copsici）、大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）、水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）和瓜亡革菌（Thanatephorus cucumeris），由實驗室保存。

1.2 培養(yǎng)基

Zobell 2216E液體培養(yǎng)基（蛋白胨5g，酵母膏1g，過濾陳海水1L）用于南極細菌培養(yǎng)。PDA培養(yǎng)基用于植物病原真菌的培養(yǎng)。

1.3 南極細菌抑菌活性的篩選及抑菌譜測定

取100μL由甘油管保存的南極細菌接種于含5mL Zobell 2216E液體培養(yǎng)基的試管中，于10℃，150 r／min振蕩培養(yǎng)7d。取1mL發(fā)酵液在4℃，12 000r／min下離心20min除去菌體，留上清液備用。

取一塊尖刀鐮孢菌的菌絲體加至含5mL無菌生理鹽水的試管中充分振蕩，用2層滅菌紗布過濾菌絲后，孢子液用二倍稀釋法稀釋至約1×105個／mL，得尖刀鐮孢菌孢子懸浮液。

將PDA培養(yǎng)基融化后冷卻至45～50℃，倒入尖刀鐮胞菌孢子懸浮液，快速混勻后倒入滅好菌的平板中，每板30mL，用孔徑為7.0mm的打孔器打孔，每孔加100μL南極細菌發(fā)酵上清液，25℃培養(yǎng)48h，測量抑菌圈直徑，將具有抑菌作用的菌株進一步復篩和純化，測定抑菌圈的直徑，每菌的抑菌圈設(shè)3個重復，計算平均值。

分別取初步篩選獲得的活性菌株的發(fā)酵上清液100μL，測定其對6種不同植物病原菌的抑制作用，確定抑菌譜。

1.4 活性菌株的分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

細菌總DNA提取，16SrRNA基因序列的擴增參考徐國英等［8］研究，測序工作由上海桑尼生物科技有限公司完成。將所測定的12株活性菌株的16SrRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov／blast／blast.cgi）進行相似性比較分析，選取與實驗菌株親緣關(guān)系較近者及南極常見細菌用BioEdit軟件的多序列比對排列（Clustalw multiple alignment）進行序列比對，采用MEGA4.1軟件的鄰接法（neighbor－joining method）進行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 培養(yǎng)條件對P4－11－07－1生長及抑菌活性影響的測定

以尖刀鐮孢菌為指示菌，分別測定了不同培養(yǎng)溫度（5，10，15，20，25，30℃）、培養(yǎng)基的不同鹽度（0，15，30，45）和不同初始pH 值（5.0，7.0，9.0，11.0）對菌株P(guān)4－11－07－1生長及抑菌活性影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 南極細菌活性菌株的篩選

以植物病原菌尖刀鐮孢菌為指示菌，采用平板擴散法，對730株南極細菌發(fā)酵上清液進行了抑菌活性研究，經(jīng)多次篩選、分離純化和活性驗證，共篩選出12株具有明顯抑菌作用的活性菌株，占篩選細菌總數(shù)的1.6%。12株活性菌株主要來源于南極水樣和磷蝦組織，其中來源于水樣的活性菌株為Z19，P4－11－07－1，1－Z11，1－Z18，4－Z11，4－Z18，IS－010－07－1，P3－11－10－1和Z18－3，來源于磷蝦組織的活性菌株為97，Linxia－4和Z27－2（表1）。

表1 南極抑菌活性菌株及其生境Table 1 Antarctic antifungal bacteria and their living environments

2.2 活性菌株抑菌譜的測定

由12株活性菌株對6種植物病原真菌的抑菌譜（表2）可以看出，所篩選到的12株活性菌株均對葡枝根霉沒有抑制作用。菌株97，Z19，P4－11－07－1，Linxia－4和Z27－2對其余5種植物病原菌均有較好的抑菌效果，但抑菌效果有所不同，97，Z19，P4－11－07－1和Z27－2對尖刀鐮孢菌的抑菌效果最明顯，Linxia－4對瓜亡革菌的抑菌效果最明顯，抑菌圈直徑均在28.00mm 以上。菌株1－Z11，1－Z18，4－Z11，4－Z18，IS－010－07－1，P3－11－10－1和Z18－3除對葡枝根霉沒有抑制作用外，對水稻紋枯病菌也無抑制作用；菌株1－Z11，1－Z18，4－Z11，4－Z18，IS－010－07－1和Z18－3對辣椒疫霉的抑菌效果最明顯，抑菌圈直徑均在23.00mm 以上；P3－11－10－1對瓜亡革菌的抑菌效果最明顯，抑菌圈直徑可達30.25mm。

表2 12株南極細菌對植物病原真菌的抑菌譜Table 2 Antifungal spectrum of 12strains of Antarctic bacteria against plant pathogenic fungi

菌株P(guān)4－11－07－1對所試驗病原真菌的抑菌效果均強于其他活性菌株，其中對尖刀鐮孢菌和瓜亡革菌的抑制作用最強，抑菌圈直徑分別達34.00，32.25mm；其次，對辣椒疫霉和大麗輪枝菌也有較強的抑制作用，抑菌圈直徑分別為29.17，28.00mm；對水稻紋枯病菌的抑制作用較弱，但抑菌圈直徑卻達19.00mm。

2.3 南極細菌16SrRNA序列分析

利用細菌16SrRNA通用引物對篩選到的12株具有抑制植物病原真菌的南極細菌基因組RNA進行擴增，獲得了長度約為1.4kb的16SrRNA序列，經(jīng)比對分析后將其提交GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得注冊號分別為：HM059656，HM059659，HM641834，HM584477～HM584481，HM584483～HM584486（表3）。

表3 12株抑菌活性菌株16SrRNA序列同源性比較Table 3 Homology comparisons of 16SrRNA sequences of 12antifungal strains

將獲得的12株活性菌株的16SrRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中相似性較高菌株的16SrRNA序列進行比對，并利用MEGA4.1軟件進行系統(tǒng)發(fā)生學分析并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1），圖中進化樹距離的計算采用Kimura雙參數(shù)計算模型，分支上的數(shù)字為1 000次bootstrap分析所得值，線段代表0.02進化距離單位，括號中的代碼代表序列在數(shù)據(jù)庫中的登錄號。結(jié)果表明，所分離到的12株活性菌株與GenBank數(shù)據(jù)庫已有菌株的16SrRNA序列均具有很高的相似性，均在99%以上；分別屬于假交替單胞屬（Pseudoalteromonas）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、倫黑墨氏菌屬（Rheinheimera），均為細菌域（Bacteria）變形桿菌門（Proteobacteria）的γ－變形桿菌（γ－Proteobacteria）。7株活性菌株（1－Z11，1－Z18，4－Z11，IS－010－07－1，Linxia－4，P3－11－10－1和 Z18－3）屬于交替單胞菌目（Alteromonadales）假交替單胞菌科（Pseudoalteromonadaceae）的假交替單胞屬，占總篩選活性菌的58.3%，為優(yōu)勢種群；3株活性菌株（Z19、P4－11－07－1、4－Z18）屬于假單胞菌目（Pseudomonadales）、莫拉菌科（Moraxellaceae）的嗜冷桿菌屬，占總篩選活性菌的25%；1株活性菌株（97）屬于著色菌目（Chromatiales）著色菌科（Chromatiaceae）的倫黑墨氏菌屬；占總篩選活性菌的8.3%；1株活性菌株（Z27－2）屬于假單胞菌目（Pseudomonadales）假單胞菌科（Pseudomonadaceae）的假單胞菌屬，占總篩選活性菌的8.3%。

圖1 抑制植物病原真菌的南極活性菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.1 Phylogenetic analysis of Antarctic antifungal bacteria

2.4 培養(yǎng)條件對菌株P(guān)4－11－07－1生長及抑菌活性的影響

2.4.1 培養(yǎng)溫度對菌株P(guān)4－11－07－1生長及抑菌活性的影響

培養(yǎng)溫度對活性菌株P(guān)4－11－07－1生長及抑菌活性的影響如圖2所示。可以看出，菌株在5～30℃之間均能生長并產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)。5，10℃培養(yǎng)時，菌株分別于培養(yǎng)24，12h進入指數(shù)生長期，60，48h進入穩(wěn)定期，之后菌體量基本維持平衡；15，20，25，30℃下培養(yǎng)12h進入對數(shù)生長期，24h進入穩(wěn)定期，之后分別于96，72，60，48h進入衰亡期。該菌株最適生長溫度為5℃，此溫度下抑菌活性最低，而培養(yǎng)溫度為25℃時，抑菌活性最高，其次為30℃。在各培養(yǎng)溫度下，菌株發(fā)酵上清液的抑菌活性均隨著培養(yǎng)時間的增加呈上升趨勢，表明該菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)在測試時間范圍內(nèi)正逐步積累。

圖2 培養(yǎng)溫度對菌株P(guān)4－11－07－1生長（a）及抑菌活性（b）的影響Fig.2 Effect of culture temperature on the growth（a）and antifungal activity（b）of strain P4－11－07－1

2.4.2 培養(yǎng)基鹽度對菌株P(guān)4－11－07－1生長及抑菌活性影響

培養(yǎng)基鹽度對菌株P(guān)4－11－07－1生長及抑菌活性影響見圖3。可以看出，菌株在培養(yǎng)基鹽度為0～45時均能生長并產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)。當培養(yǎng)基鹽度為0時菌株生長達最大值，此時抑菌活性也達最大值，隨著鹽度的增加菌株生長和抑菌活性均呈下降趨勢。

圖3 培養(yǎng)基鹽度對菌株P(guān)4－11－07－1生長（a）及抑菌活性（b）的影響Fig.3 Effect of medium salinity on the growth（a）and antifungal activity（b）of strain P4－11－07－1

2.4.3 培養(yǎng)基初始pH 值對P4－11－07－1生長及抑菌活性影響

培養(yǎng)基初始pH值對P4－11－07－1生長及抑菌活性影響見圖4?？梢钥闯觯斉囵B(yǎng)基初始pH值在5.0～11.0之間時菌株均能生長并產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)。當培養(yǎng)基的初始pH值為8.0時最適合菌株生長，其次為9.0；當培養(yǎng)基的初始pH值為7.0時，抑菌活性達最大值，其次為8.0；當培養(yǎng)基初始pH值為11.0時，菌株生長量和抑菌活性均最低。

圖4 培養(yǎng)基初始pH 值對菌株P(guān)4－11－07－1生長（a）及抑菌活性（b）的影響Fig.4 Effect of medium initial pH on the growth（a）and antifungal activity（b）of strain P4－11－07－1

3 討 論

本研究通過平板擴散法篩選到12株具有明顯抑制植物病原真菌作用的南極細菌，占總分離數(shù)的1.6%，小于姜健等［9］和朱鵬等［10］從常規(guī)海洋細菌篩選到的活性菌株的比例，其原因可能為：1）篩選模式不同。本研究只選用一種植物病原菌尖刀鐮孢菌作為指示菌，而姜健等［9］和朱鵬等［10］采用多種指示菌進行篩選，有些南極細菌對尖刀鐮孢菌沒有抑制活性，但對其它病原菌可能會有活性，這樣就可能會造成篩選活性菌株的減少；2）環(huán)境條件的影響。微生物次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生會受環(huán)境的影響，生活在南極的微生物會產(chǎn)生某種特殊的物質(zhì)以適應(yīng)周圍環(huán)境，這些微生物一旦離開原來的生境，可能就不再產(chǎn)生這種物質(zhì)；3）培養(yǎng)條件的影響。微生物代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生受培養(yǎng)條件的限制，本論文只采用Zobell 2216E一種培養(yǎng)基培養(yǎng)南極細菌，可能影響某些細菌產(chǎn)生抑菌物質(zhì)。

對分離到的活性菌株的分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析表明，篩選到的南極活性細菌分別屬于假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和倫黑墨氏菌屬（Rheinheimera），其中假交替單胞菌屬為優(yōu)勢種群。目前已有關(guān)于假單胞菌屬（Pseudomonas）、假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的報道，如Isnansety等［11］分離到一株海洋細菌Pseudoalteromonas phenolicasp.nov.O－BC30，能產(chǎn)生一類抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和腸球菌（Enterococcus）的含酚的抗生素 MC21［12－13］；Jayatilake等［14］從一株南極細菌Pseudomonas aeruginosa代謝產(chǎn)物中分離到6種二酮類吡嗪類化合物、2種吩嗪生物堿類抗生素，其代謝產(chǎn)物能抑制革蘭氏陽性菌生長。而嗜冷桿菌屬、倫黑墨氏菌屬細菌產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)尚未見報道。

菌株P(guān)4－11－07－1具有較廣的溫度、鹽度和pH適應(yīng)性，在培養(yǎng)溫度5～30℃，培養(yǎng)基鹽度0～45及初始pH值5.0～11.0范圍內(nèi)，均能生長并產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)，該特性與郭少華等［14］報道的南極海單胞菌Marinomonassp.BSwl0005相似，其可在常溫（28℃）、低鹽度（5）條件下培養(yǎng)。這表明盡管這些活性菌株生長于極地海洋環(huán)境，它們?nèi)钥梢赃m應(yīng)低鹽和較高溫度的培養(yǎng)條件，從而基本上避免了大規(guī)模培養(yǎng)時低溫培養(yǎng)條件的限制，低鹽需求也可使發(fā)酵設(shè)備免受侵蝕，從而更有利于實際生產(chǎn)。筆者將對菌株P(guān)4－11－07－1產(chǎn)活性物質(zhì)的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定展開進一步研究。

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Screening of Antarctic Bacteria With Antifungal Activity AgainstFusarium oxysporumand Growth Characteristics ofPsychrobactersp.P4－11－07－1

WANG Hong－mei1，2，3，HE Pei－qing2，3，LIN Xue－zheng2，3，DONG Yong－sheng1
（1.School of Food and biological Engineering，Shandong Institute of Light Industry，Jinan 250353，China；2.First Institute of Oceanography，SOA，Qingdao 266061，China；3.Key Laboratory of Marine Bioactive Substances，SOA，Qingdao 266061，China）

The 12strains of Antarctic bacteria with antifungal activity against plant pathogenic fungi were screened withFusarium oxysporumas indicator by method of agar diffusion.Phylogenetic analysis and antifungal spectrum of antifungal strains were studied.Molecular identification and phylogenetic analysis showed that seven antifungal strains belonged to genera ofPseudoalteromona，three strains were members ofPsychrobacter，and the rest two strains belonged to genus ofPseudomonasandRheinheimera，respectively.Antifungal spectrum test displayed that the antifungal strains had different antifungal spectrum.All of the 12strains had a certain antifungal activity onFusarium oxysporum，Phytophthora copsici，Verticillium dahliae，Thanatephorus cucumeris，and no activity onRhizopus stolonifer.Except strain 1－Z11，1－Z18，4－Z11，4－Z18，IS－010－07－1，P3－11－10－1and Z18－3，the others had antifungal activity onRhizopus stolonifer.The results of growth conditions ofPsychrobactersp.P4－11－07－1with stronger antifungal activity demonstrated that it could grow and produce antifungal substances as the culture temperature was 5～30℃，the medium salinity was 0～45and initial pH was 5.0～11.0.The corresponding highest antifungal activity was detected at 25℃，salinity 0，and pH 7.0.

Antarctic bacteria；antifungal activity；molecular identification；growth characteristics

October 28，2010

Q935

A

1671－6647（2012）01－0102－09

2010－10－28

國家海洋局海洋公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費項目——深遠海（極地）微生物生物農(nóng)藥的研制與中試示范（201005032－2）；國家高新技術(shù)研究發(fā)展計劃項目——極地特殊海洋微生物資源利用的關(guān)鍵技術(shù)研究（2007AA091905）

王紅梅（1986－），女，山東濟寧人，碩士，主要從事極端環(huán)境微生物方面研究.E－mail：wanghongmei0711＠126.com

＊通訊作者，研究員，E－mail：linxz＠fio.org.cn

（王佳實 編輯）