賀 雄，曹文富,趙蘋(píng)利,李 艷,黃 欣

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科 400016)

肺纖維化是肺組織在受到外界各種刺激后，引起的肺組織炎性損傷，結(jié)構(gòu)破壞，逐漸伴有肺間質(zhì)細(xì)胞增生的組織修復(fù)過(guò)程。研究表明，大量的細(xì)胞因子參與纖維化進(jìn)程中，其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是促進(jìn)纖維細(xì)胞激活向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因子[1-2]，也是目前最公認(rèn)的致纖維化細(xì)胞因子；纖溶酶原激活物抑制物(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)則主要參與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrixc,ECM)的降解過(guò)程，PAI-1的增加會(huì)導(dǎo)致ECM降解減少，致使ECM的生成與降解失衡，最終導(dǎo)致肺纖維化[3]。目前治療肺纖維化以激素和免疫抑制劑為主，但尚無(wú)較理想的藥物，如何通過(guò)有效抑制TGF-β1等因子的表達(dá)，使ECM的生成減少，或者減少PAI-1等因子的生成而促進(jìn)ECM降解，最終改善肺組織代謝狀況等新途徑來(lái)治療肺纖維化，成為當(dāng)前該領(lǐng)域研究的重點(diǎn)[4-5]。本研究基于西醫(yī)對(duì)肺纖維化理論的認(rèn)識(shí)和中醫(yī)藥治療肺纖維化的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，采用益氣化瘀化痰法探索治療肺纖維化的新途徑，選用黃芪、白術(shù)、川芎、姜黃、半夏、海藻共六味中藥，對(duì)博來(lái)霉素致肺纖維化大鼠進(jìn)行治療，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 SD大鼠105只(雌雄不限)，體質(zhì)量180～220 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(渝)2007-0001，SPF級(jí)清潔環(huán)境喂養(yǎng)；鹽酸博來(lái)霉素由日本化藥株式會(huì)社生產(chǎn)(批號(hào)：H20090885，規(guī)格15 毫克/瓶)；氫化可的松注射液由天津金耀氨基酸有限公司生產(chǎn)(批號(hào)：H12020887，規(guī)格：20 毫升/支)；大鼠PAI-1 ELISA試劑盒由重慶鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司提供(RD分裝)；TGF-β1蛋白抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品；中藥飲片由重慶桐君閣中藥批發(fā)有限責(zé)任公司提供；實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的測(cè)定在重慶醫(yī)科大學(xué)眼科學(xué)重慶市市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2動(dòng)物分組與肺纖維化模型建立 采用隨機(jī)法將105只大鼠分為7組：正常對(duì)照組、模型組、激素組、益氣組、化瘀組、化痰組、益氣化瘀化痰組，每組各15只。適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，對(duì)照組一次性氣管內(nèi)注射生理鹽水0.1 mL/100 g，其余各組均采用一次性氣管內(nèi)注射等量鹽酸博來(lái)霉素(5 mg/kg)制作大鼠肺纖維化模型[6-7]，于造模后28 d處死模型組3只大鼠，電鏡下觀察纖維化造模是否成功，然后給予中藥及激素干預(yù)治療。益氣組由黃芪、白術(shù)組成煎劑灌胃，化痰組由半夏、海藻組成煎劑灌胃，化瘀組由川芎、姜黃組成煎劑灌胃，益氣化瘀化痰組由以上所有中藥組成煎劑灌胃，各組煎劑中按照每1 mL含生藥2 g進(jìn)行熬制，各組灌胃劑量按照30 g·kg-1·d-1進(jìn)行。激素組給予氫化可的松5 mg·kg-1·d-1進(jìn)行腹腔注射。模型組及正常對(duì)照組每日給予等量生理鹽水灌胃，干預(yù)2個(gè)月后處死全部大鼠。

1.3標(biāo)本取材與處理

1.3.1血漿采集 10%水合氯醛按0.3 mL/100 g劑量腹腔注射麻醉大鼠，常規(guī)消毒，備皮，切開(kāi)胸腔，暴露心臟，將空針直刺入心室取血，置于抗凝管內(nèi)，搖勻，3 000 r/min離心10 min后取上清液分裝在1.5 mL離心管內(nèi)，―80 ℃冰箱中保存待檢。

1.3.2肺組織勻漿上清液備制 將采血完后的大鼠立即置于4 ℃冰盒上，將肺組織剪成小塊狀，生理鹽水清洗，稱(chēng)質(zhì)量，加入裂解液，蛋白酶抑制劑，超聲打碎，直至組織完全裂解，3 000 r/min離心7 min后取勻漿上清液分裝在1.5 mL離心管內(nèi)，置于―20 ℃冰箱中保存待檢。

1.4血漿PAI-1和肺組織TGF-β1水平測(cè)定

1.4.1血漿PAI-1測(cè)定 采用ELISA法，敏感度為1.0 pg/mL，操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4.2肺組織TGF-β1測(cè)定 采用Western blot法，取肺組織勻漿上清液，先用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑測(cè)定每組大鼠肺組織TGF-β1蛋白含量，再按照SDS-PAGE電泳，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜，膜的封閉，抗體孵育，化學(xué)發(fā)光，顯影，定影，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)蛋白帶的相對(duì)分子質(zhì)量，用Image J軟件計(jì)算蛋白凈光密度值。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠一般情況比較 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠第2天表現(xiàn)為精神極差，毛發(fā)疏松聳立，活動(dòng)及進(jìn)食均明顯減少；造模后第3天或4天，除了出現(xiàn)上述癥狀外，大鼠雙眼、鼻部、唇部及舌體顏色明顯變?yōu)鹾诎档?，表現(xiàn)出嚴(yán)重的缺血缺氧狀態(tài)，體質(zhì)量也逐漸減輕。造模28 d后模型組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)電鏡照片，見(jiàn)封2圖1。造模過(guò)程中約1/6的大鼠會(huì)出現(xiàn)腹部脹大，且逐漸加重，直至腹脹如蛙腹，大便稀溏，極度消瘦等癥狀，甚至死亡。經(jīng)中藥干預(yù)治療后，大鼠的精神、毛發(fā)、活動(dòng)等一般情況得到有效改善。益氣化瘀化痰組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)電鏡照片，見(jiàn)封2圖2。

2.2各組大鼠血漿PAI-1水平 各組大鼠血漿PAI-1水平見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠PAI-1水平

*：P<0.05，與正常對(duì)照組比較;Δ：P<0.05，與模型組比較;☆：P<0.05，與益氣組、化痰組、化瘀組比較;◇：P<0.05，與益氣化痰化瘀組比較。

2.3各組大鼠肺組織TGF-β1蛋白表達(dá)情況 各組大鼠肺組織TGF-β1蛋白表達(dá)情況見(jiàn)圖3，表2。

注：圖片條帶從左到右依次為化瘀組、模型組、益氣化瘀化痰組、益氣組、激素組、化痰組、正常對(duì)照組。

圖4各組大鼠肺組織Western blot電泳照片

表2 各組大鼠肺組織TGF-β1蛋白表達(dá)情況

*：P<0.05，與正常對(duì)照組比較;Δ：P<0.05，與模型組比較;☆：P<0.05，與益氣組、化痰組、化瘀組比較。

3 討 論

TGF-β1是一種參與各種生物過(guò)程的多功能細(xì)胞因子，如胚胎發(fā)育，腫瘤的生長(zhǎng)和分化，細(xì)胞增殖和凋亡，纖維組織的修復(fù)和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等[8-9]。TGF-β1表達(dá)的上調(diào)是肺、肝、腎等纖維化疾病產(chǎn)生的關(guān)鍵步驟[10-11]。PAI-1是絲氨酸蛋白酶抑制劑家族成員之一，能調(diào)節(jié)纖溶蛋白水解和抑制纖溶酶原激活。血漿PAI-1水平的升高可作為觀察各種血栓形成的條件，包括心肌梗死、深靜脈血栓和彌散性血管內(nèi)凝血等[12-13]。肺纖維化、腎小球腎炎等PAI-1基因的表達(dá)水平明顯增加，同時(shí)研究證明PAI-1還可以使TGF-β1信號(hào)明顯增強(qiáng)，進(jìn)一步導(dǎo)致ECM的積累和增加PAI -1的表達(dá)，形成纖維化進(jìn)程的惡性循環(huán)[14-15]。目前爭(zhēng)對(duì)上述兩種細(xì)胞因子在纖維化進(jìn)程中的具體作用機(jī)制尚未充分認(rèn)識(shí)，因此西醫(yī)目前未研究出一種能作用在這兩種細(xì)胞因子上的有效藥物。

在已知纖維化形成的相關(guān)機(jī)理上，采用傳統(tǒng)中醫(yī)藥進(jìn)行研究，有利于中西醫(yī)理論更深層次的結(jié)合。中醫(yī)在肺纖維化的治療中強(qiáng)調(diào)益氣、化瘀、化痰，通過(guò)補(bǔ)益肺氣，使津液正常運(yùn)化代謝，從而阻斷痰濁生成；通過(guò)化瘀化痰，以消除實(shí)邪，達(dá)到邪扶正之功效。本研究中選取益氣藥黃芪和白術(shù)，其中黃芪為補(bǔ)氣之要藥，尤其針對(duì)肺脾氣虛效果顯著，配白術(shù)以增強(qiáng)其補(bǔ)氣功效，相關(guān)文獻(xiàn)已有報(bào)道黃芪能夠延緩甚至抑制纖維化的進(jìn)程；化瘀藥選取川芎和姜黃，其中川芎為“血中之氣藥”，對(duì)氣滯血瘀證作用明顯，文獻(xiàn)報(bào)道其主要成分川芎嗪能降低博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠血清及肺組織TGF-β1的表達(dá)[9]，降低肺纖維化的增生程度，并配姜黃以加強(qiáng)行氣活血之功；化痰藥選取半夏和海藻，其中半夏為治療痰證的要藥，健脾化痰以消除生痰之源，配海藻以增強(qiáng)其化痰散結(jié)的功效。以上六味中藥配伍能達(dá)到祛實(shí)邪、補(bǔ)肺氣的作用效果。

相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道經(jīng)博來(lái)霉素誘導(dǎo)生成的大鼠肺纖維化模型致死率可高達(dá)50%，且部分大鼠肺組織在造模后28 d有自限性?xún)A向，在本實(shí)驗(yàn)中造模后大鼠的致死率約為40%，需通過(guò)反復(fù)造模來(lái)保證大鼠纖維化模型的數(shù)量，且28 d后未發(fā)現(xiàn)自限性?xún)A向。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，益氣化瘀化痰組大鼠血漿PAI-1水平較模型組明顯降低(P<0.05)，且效果優(yōu)于其他中藥組(P<0.05)；益氣化瘀化痰組大鼠TGF-β1蛋白表達(dá)光密度值明顯低于模型組，與正常對(duì)照組和激素組數(shù)值較為接近。根據(jù)本研究結(jié)果推測(cè)，益氣化瘀化痰可以有效降低血漿PAI-1含量及肺組織TGF-β1的表達(dá)，從而在一定程度上抑制了ECM的生成和堆積，增加了組織纖維的降解，達(dá)到改善肺組織纖維化的治療效果。本研究結(jié)果還可推廣至肝、腎等器官纖維化的治療，但其具體的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究。

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