閔長莉，王 允，汪學(xué)軍

（1.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012；2.安徽省植物生物技術(shù)實(shí)訓(xùn)中心，安徽 六安 237012）

博落回內(nèi)生真菌的分離及其抗菌活性的初步研究

閔長莉1，2，王 允1，汪學(xué)軍2

（1.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012；2.安徽省植物生物技術(shù)實(shí)訓(xùn)中心，安徽 六安 237012）

從健康博落回植株中分離內(nèi)生真菌，用PDA培養(yǎng)基分離純化菌株，結(jié)果純化得到19株內(nèi)生真菌，用瓊脂塊法對獲取的菌株進(jìn)行抗菌活性篩選，其中有2株博落回內(nèi)生真菌對指示菌株有抑菌作用，占總分離菌株的10.53%，其中有一株內(nèi)生真菌具有較強(qiáng)的抑菌活性。

博落回；內(nèi)生真菌；分離；抗菌活性

博落回（Macleayacordata（Willd）R.Br.）又名號筒桿，系罌粟科植物，全株均可入藥。博落回在我國長江中下游地區(qū)廣泛分布，民間作為殺蟲農(nóng)藥和治療疥癬等在我國有著悠久的歷史。近年來國內(nèi)外研究結(jié)果表明：博落回全草中富含多種生物堿［1］［2］（P133）［3］，這些生物堿多屬于異喹啉衍生物，具有驅(qū)蟲、抗菌、消腫、止咳、平喘、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤等功效。臨床已用于痔瘡、膿性指頭炎、滴蟲性陰道炎、宮頸糜爛等的治療，效果顯著［4］。作為植物源農(nóng)藥，博落回有效活性成分的獲得主要從植株中獲取，因此會(huì)受到季節(jié)的限制，且要大量砍伐博落回，會(huì)造成資源不合理利用和物種枯竭。所以，探尋獲取博落回有效活性成分的新途徑成為現(xiàn)今需要解決的問題。

從近年來的研究看，植物體中存在內(nèi)生真菌是普遍的。植物內(nèi)生真菌能產(chǎn)生新的天然產(chǎn)物，甚至可以產(chǎn)生與宿主植物相同或相近的代謝產(chǎn)物，因而成為天然產(chǎn)物的重要來源［5］。1993年Stierle等［6］首次從太平洋短葉紅豆杉（Taxomycesandrenae）中分離到可產(chǎn)生抗癌藥物紫杉醇的內(nèi)生真菌，云南大學(xué)郭波、李海燕、張玲琪等人分別從長春花（Catharanthusroseus）、桃兒七（Sinopodophyllumhexandrum）中分離出產(chǎn)長春花堿和鬼臼毒素類似物的內(nèi)生真菌［7］［8］，而本課題組也從喜樹（CamptothecaacuminataDecne）中分離出產(chǎn)10－羥基喜樹堿的內(nèi)生真菌［9］［10］。目前，博落回內(nèi)生真菌的研究還鮮見有報(bào)導(dǎo)。因此，開展博落回內(nèi)生真菌的分離及其代謝產(chǎn)物的研究，無疑將為人類從微生物角度尋找博落回有效活性成分開辟一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 植物材料 博落回植株于2011年8月采自安徽省金寨縣天堂寨風(fēng)景區(qū)，經(jīng)妥善處理后帶回實(shí)驗(yàn)室供試。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)菌株 革蘭陰性細(xì)菌：大腸桿菌（Escherichiacoli），銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）；革蘭陽性菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）；均購自中國普通微生物菌種保藏中心。

1.1.3 主要器械 恒溫恒濕培養(yǎng)箱（PYX－150HA），科立儀器；電熱蒸汽壓力消毒器（YX－450），上海三申醫(yī)療器械有限公司；潔凈工作臺（SW－CJ－1C（U）），蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；照相機(jī)（佳能650）。

1.2 培養(yǎng)基配制

1.2.1 內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基［11］。

1.2.2 指示菌培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基［11］。

1.3 內(nèi)生真菌的分離

分別將博落回根、莖、葉在自來水下沖凈后進(jìn)行表面消毒，先用75%的酒精浸洗2分鐘，無菌水沖洗4次，0.1%升汞消毒2分鐘，無菌水沖洗4次，再用無菌刀片將材料切成小塊后，將上述組織塊置于PDA培養(yǎng)基上于恒溫箱進(jìn)行28℃恒溫培養(yǎng)，與此同時(shí)將上述消毒過程中最后一次沖洗組織塊的無菌水滴在培養(yǎng)基上平行培養(yǎng)，用以檢測博落回植株表面消毒是否徹底。培養(yǎng)3-4天后，及時(shí)采用尖端菌絲挑取法，挑取形態(tài)不同的菌落接種到新鮮PDA平板上。純化3-5次直到得到形態(tài)完全一致的單菌落即純化的內(nèi)生真菌。

1.4 抗菌實(shí)驗(yàn)

1.4.1 指示菌的活化與菌懸液制備 大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌分別接種于直徑為90mm牛肉膏蛋白胨平板上于37℃活化18h。用接種鏟分別刮取上述四種指示菌菌株至加有玻璃珠30m L無菌生理鹽水中，放置于搖床震蕩30min，使菌體分散均勻，制備成菌懸液后放置于4℃冰箱中備用。

供試菌株的處理：將分離純化得到的內(nèi)生真菌分別接種于PDA平板上28℃培養(yǎng)7-14d，用直徑6mm的無菌打孔器打孔，制成菌餅。

1.4.2 抑菌實(shí)驗(yàn) 采用瓊脂塊法。分別取1.4.1活化指示菌懸液0.2m L于牛肉膏蛋白胨平板上，用玻璃涂布器涂布均勻后，再把所分離得到的內(nèi)生真菌菌餅置于指示菌平板中央，培養(yǎng)1-2d；測量并記錄各菌餅抑菌圈的大小。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌的分離結(jié)果

從博落回根、莖、葉材料中共分離到內(nèi)生真菌19株（結(jié)果見表1），從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出在莖、葉部位分離純化得到的內(nèi)生數(shù)目較多，而根部最少。

表1 博落回內(nèi)生真菌分離結(jié)果

2.2 內(nèi)生真菌的抗菌活性

對上述19株內(nèi)生真菌分別進(jìn)行抑菌活性篩選，結(jié)果篩選得到2株內(nèi)生真菌對供試菌株有抗菌活性，占分離菌株總數(shù)的10.53%；其中，由根部分離得到的內(nèi)生真菌BLH005和由莖部分離得到的內(nèi)生真菌BLH009對金黃色葡萄球菌均有抑制作用，抑菌圈大小分別為4.21cm、1.15cm；對另外三種指示菌無抑制作用，且內(nèi)生真菌BLH005具有較強(qiáng)的抑菌活性。

2.3 有抑菌活性內(nèi)生真菌的形態(tài)特征

2.3.1 菌株BLH005 該菌株在PDA平板上生長緩慢，呈放射狀生長，5d后菌落的直徑約為3cm；菌落在5d內(nèi)顏色純白色，并且在菌落表面有水滴樣滲出物，背面灰白色；7d后菌落表面開始變?yōu)榛野咨?，邊緣不太整齊，菌絲致密；9d后在PDA培養(yǎng)基上背面出現(xiàn)暗紅色色素、正面顏色變化不大（如圖1A所示）。

2.3.2 菌株BLH009 該菌生長緩慢，在生長初期，菌落直徑較小，菌落表面淺綠色，質(zhì)地緊密，邊緣較整齊。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，菌落直徑逐步變大，至培養(yǎng)5d時(shí)，可達(dá)1.6cm，且顏色變深為墨綠色，菌落邊緣呈現(xiàn)一個(gè)白邊，中央隆起，高度達(dá)0.5mm左右（如圖1B所示）。

圖1 菌株BLH005和菌株BLH009在PDA上的形態(tài)結(jié)構(gòu)圖A：菌株BLH005；B：菌株BLH009

3 討論

自從Guerin等（1898）從黑麥草中分離出第一株內(nèi)生真菌以來，關(guān)于內(nèi)生真菌的研究已有100多年的歷史。研究發(fā)現(xiàn)它在植物組織中普遍存在，并具有豐富的物種多樣性［12］［13］。到目前為止，人們對博落回內(nèi)生真菌的研究方面鮮見有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)。因此，開展博落回內(nèi)生真菌的研究，可以更加全面反映自然界中內(nèi)生真菌的多樣性，發(fā)掘出內(nèi)生真菌新資源，為進(jìn)一步篩選博落回內(nèi)生真菌活性物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

從近年來的研究看，植物內(nèi)生真菌具有普遍的抑菌活性［14－16］。本研究從博落回中分離得到的19株內(nèi)生真菌，其中對金黃色葡萄球菌具有拮抗活性的菌株占到總菌株數(shù)的10.53%，也再次印證了這個(gè)觀點(diǎn)；并且發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌BLH005的代謝產(chǎn)物具有較高的抑菌活性。

［1］胡之壁，徐垠，馮勝初，等.博落回果實(shí)中有效成分的研究［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1979，14（9）：35－540.

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A Preliminary Study on Isolation of Endophytic Fungi fromMacleaya
Cordataand Its Antimicrobial Activity

MIN Chang-li1，2，WANG Yun1，WANG Xue-jun2
（1.CollegeofBiotechnologyandPharmaceuticalEngineering，WestAnhuiUniversity，Lu’an237012，China2.AnhuiPlantBiotechnologyTrainingCentre，Lu’an237012，China）

Nineteen endophytic fungal strains were isolated from the healthyMacleayacordataby flat-panel separation.Agar block method was used to obtain the strain for antimicrobial activity screening.The results showed that two endophytic fungi（10.53%of the total strains isolated）had inhibitory activities to the test strains，and a strong inhibitory activity of endophytic fungus was also be found.

Macleaya cordata；endophytic fungi；isolation；antimicrobial activit y

Q932.331

A

1009－9735（2012）02－0004－03

2012－03－13

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31100019）。

閔長莉（1975－），女，安徽霍邱人，皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院講師，碩士，研究方向：微生物藥物學(xué)。