朱海龍 張根葆 張 翠 (南京醫(yī)科大學(xué)附屬江寧醫(yī)院，江蘇 南京 200)

彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)是以機體凝血系統(tǒng)功能紊亂為特征，以出血、貧血、休克、多器官損傷為表現(xiàn)的危急重癥。內(nèi)毒素可通過誘導(dǎo)單核細胞、內(nèi)皮細胞釋放腫瘤壞死因子(TNF)、白介素(IL)-1、IL-6等細胞因子而激活凝血系統(tǒng)，最終誘發(fā)DIC〔1〕。DIC時微血栓的大量形成，以及炎癥損傷，又可促進多器官功能障礙綜合征(MODS)的發(fā)生〔2，3〕。調(diào)查顯示，當(dāng)DIC伴發(fā)多器官功能損傷時患者病死率將明顯增高〔4〕。因此加強DIC多器官損傷的防治研究，對降低患者病死率具有十分重要的意義。柴胡為傳統(tǒng)中藥材，其主要成分柴胡皂苷具有抗炎、保肝的功效〔5〕。為了進一步了解柴胡對內(nèi)毒素DIC多器官損傷的影響，本研究以大鼠為對象，建立內(nèi)毒素DIC多器官損傷模型，初步探討柴胡的防治功效及作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑 脂多糖(LPS，E coli 055：B5，美國Sigma公司)，柴胡注射液(咸陽泰鑫藥業(yè)有限公司)，APTT及FIB測定試劑盒(上海太陽生物技術(shù)有限公司)，磷酸化ERK1/2兔抗鼠單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體(美國Santa Cruz公司)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器 MC-2000型全自動血凝儀(德國MDC公司)，Au400型全自動生化儀(日本Olympus公司)，BX41型雙目顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 實驗動物 SD大鼠，32只，雌性，體重210～230 g，由南京青龍山動物繁殖場提供。

1.4 方法

1.4.1 造模 32只SD大鼠隨機分為4組：對照組、模型組和柴胡低、高劑量組。參考文獻〔6〕的方法，略加改動復(fù)制大鼠DIC模型，具體步驟為：大鼠空腹12 h后，對照組腹腔注射生理鹽水4 ml/kg，模型組腹腔注射6 mg/kg LPS，柴胡低、高劑量組分別腹腔注射0.2，0.4 g/kg柴胡注射液和6 mg/kg LPS。

1.4.2 實驗室檢查 各組大鼠在藥品注射結(jié)束后5 h時，腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉麻醉。頸總動脈插管取血，并用3.8%枸櫞酸鈉1∶9抗凝。離心后取血漿，利用MC-2000血凝儀及Olympus Au400生化儀測定活化部分凝血活酶時間(APTT)、纖維蛋白原(FIB)、乳酸脫氫酶(LDH)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、尿素(BUN)及肌酐(CRE)等指標(biāo)。

1.4.3 標(biāo)本采集 各組大鼠取血后，立即留取心、肝、腎等臟器，甲醛固定、石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下檢查各臟器組織病理變化。同時行免疫組化檢測肝組織中磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(p-ERK 1/2)的分布，具體步驟如下：病理切片常規(guī)脫蠟至水，微波修復(fù)，羊血清封閉，兔抗鼠磷酸化ERK1/2單克隆抗體1∶200稀釋，37℃孵育1 h，4℃ 冰箱過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗37℃ 孵育1 h，DAB顯色。結(jié)果判斷：胞核和/或胞質(zhì)中呈棕黃色為陽性細胞。

2 結(jié)果

2.1 各組凝血及生化指標(biāo)變化 與對照組相比，模型組各凝血及生化指標(biāo)變化顯著(P＜0.01);與模型組相比，柴胡低劑量組各生化指標(biāo)均顯著下降(P＜0.01)，凝血指標(biāo)APTT也有所改善(P＜0.05)，而FIB的變化無統(tǒng)計學(xué)意義;柴胡高劑量組凝血及生化指標(biāo)均較模型組顯著改善(P＜0.01)。見表1、表2。

2.2 各組織病理學(xué)變化 對照組心肝腎組織肉眼觀無明顯異常。模型組肝臟表面肉眼可見廣泛點狀出血;光鏡下可見心內(nèi)膜下片狀出血，部分肝細胞水腫變性，肝細胞索排列紊亂，肝竇及間質(zhì)血管擴張充血，腎小球及間質(zhì)血管擴張充血，腎小管上皮細胞水腫變性。與模型組相比，柴胡低、高劑量組心肝腎等臟器結(jié)構(gòu)基本趨于正常，充血出血明顯減輕。見圖1～圖3。

2.3 p-ERK 1/2蛋白在肝組織中的分布 ERK1/2主要為胞質(zhì)陽性，對照組未見p-ERK1/2陽性表達。模型組則陽性細胞明顯增多，廣泛分布于肝細胞。柴胡低、高劑量組陽性細胞密度較模型組明顯降低。見圖4。

表1 4組大鼠凝血指標(biāo)變化(± s，n=8)

表1 4組大鼠凝血指標(biāo)變化(± s，n=8)

與對照組比較：1)P ＜0.01;與模型組比較：2)P ＜0.05，3)P ＜0.01

組別 劑量(g/kg) APTT(s) FIB(mg/dl)對照組 －20.51±0.88 423.63±6.04模型組 － 45.35±2.081) 54.75±3.491)柴胡組 0.2 38.69±1.631)2) 52.88±1.941)0.4 37.34±1.201)3) 170.25±9.571)3)

圖1 4組大鼠心臟組織病理變化(HE，×100)

圖2 4組大鼠肝組織病理變化(HE，×100)

圖3 4組大鼠腎組織病理變化(HE，×100)

圖4 肝組織p-ERK1/2免疫組織化學(xué)結(jié)果(IHC，×100)

表2 4組大鼠血生化指標(biāo)變化(± s，n=8)

表2 4組大鼠血生化指標(biāo)變化(± s，n=8)

與對照組比較：1)P＜0.01;與模型組比較：2)P＜0.01

組別 劑量(g/kg) LDH(U/L) ALT(U/L) AST(U/L) BUN(mmol/L) CRE(μmol/L)對照組 － 109.88±12.55 28.65±1.95 59.50±2.97 4.30±2.00 45.78±1.55模型組 － 2 472.00±66.511) 897.71±24.851) 517.88±7.111) 11.30±0.341) 85.53±1.781)柴胡組 0.2 354.88±18.311)2) 45.01±1.641)2) 175.88±8.431)2) 9.03±0.401)2) 61.76±2.061)2)0.4 225.50±8.051)2) 41.49±3.201)2) 131.75±4.311)2) 8.63±0.241)2) 54.30±1.291)2)

3 討論

DIC是因凝血系統(tǒng)過度激活，繼而出現(xiàn)凝血功能障礙，最終引起出血傾向的臨床病理過程。與國外不同，在我國引起DIC的首要因素為感染，約占30% ～40%，其中又以革蘭陰性細菌感染最為多見，約占65%。內(nèi)毒素(ET)是革蘭陰性細菌(G－)的主要致病成分。內(nèi)毒素通過誘導(dǎo)單核細胞、內(nèi)皮細胞釋放TNF、IL-1、IL-6 等炎癥因子而激活凝血系統(tǒng)，最終引發(fā) DIC〔1〕。同時，炎癥因子所誘發(fā)的炎癥反應(yīng)又可對各種組織器官造成損傷，再者DIC微血栓形成所造成的微循環(huán)失衡，嚴重時也可導(dǎo)致或促進MODS的發(fā)生〔2，3〕。MODS是一個以上器官功能發(fā)生障礙甚至衰竭，其預(yù)后較差。調(diào)查顯示，任何單一器官系統(tǒng)持續(xù)衰竭24 h以上的死亡率約10%，兩個系統(tǒng)以上衰竭的死亡率為60%，若涉及三個系統(tǒng)衰竭＞72 h以上者，死亡率近100%。國外文獻報道：美國所有入住 ICU的病人，約80%病人死于MODS〔4〕。因此加強DIC多器官損傷的防治研究，有著重要的現(xiàn)實意義。

柴胡注射液以柴胡一味中藥，經(jīng)提煉而成。柴胡為傳統(tǒng)中藥材，其成分主要為柴胡皂苷、甾醇、揮發(fā)油等，其中又以柴胡皂苷最具生物活性。國內(nèi)外的眾多研究表明柴胡皂苷具有解熱、抗炎、免疫調(diào)節(jié)及保肝等功效〔6〕。本研究采用內(nèi)毒素來復(fù)制DIC多器官損傷模型，模型組各項凝血及生化指標(biāo)較對照組明顯改變，各器官組織擴張充血明顯，符合動物DIC診斷標(biāo)準(zhǔn)。柴胡注射液處理后各器官功能指標(biāo)均顯著改善，形態(tài)學(xué)可見各臟器損傷減輕。這表明柴胡能夠減輕內(nèi)毒素所致的DIC多器官損傷。

有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路是生物體內(nèi)重要的炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一，到目前為止已有4種MAPK亞家族被發(fā)現(xiàn)，分別為細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)、c-Jun氨基未端激酶(JNK)等。這些MAPK亞家族成員能被多種炎性刺激所激活，并對炎癥的發(fā)生、發(fā)展起重要調(diào)控作用。有報道顯示〔7〕，柴胡皂苷d能夠抑制Jun氨基末端激酶(MAPK家族成員)的磷酸化，這提示柴胡的抗炎機制與炎癥信號通路的抑制有關(guān)。Dang等〔8〕研究證實，柴胡皂苷d可能通過對NF-κB炎癥通路的抑制，而減少TNF-α、IL-6等細胞因子的釋放。與文獻報道相似，本實驗免疫組化顯示模型組肝組織陽性細胞密度較高，而柴胡組陽性細胞密度減低，這提示柴胡可能具有干擾ERK1/2炎癥通路的作用。我們此前的研究表明ERK 1/2信號通路與內(nèi)毒素DIC的凝血功能紊亂及多器官損傷過程具有相關(guān)性，阻斷ERK1/2信號通路對內(nèi)毒素DIC大鼠的器官損傷具有保護作用。這提示柴胡可能通過抑制ERK1/2炎癥通路，進而減輕內(nèi)毒素DIC的器官損傷。然而ERK1/2信號通路涉及多個環(huán)節(jié)，多種激酶的磷酸化，其具體機制有待進一步的研究。

綜上所述，本研究提示柴胡注射液可以減輕內(nèi)毒素DIC的多器官損傷，其機制可能與ERK1/2信號通路的阻斷有關(guān)，這為內(nèi)毒素DIC多器官損傷的臨床防治提供了實驗資料。

1 Hidesaku Asakura，Yoko Sano，Mika Omote，et al.Beneficial effect of lowmolecular-weight heparin against lipopolysaccharide-induced disseminated intravascular coagulation in rats is abolished by coad ministration of tranexamic acid〔J〕.Intensive Care Med，2004;30(10)：1950-5.

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3 Taylor FB Jr，Toh CH，Hoots WK，et al.Towards definition，clinical and laboratory criteria，and a scoring system for disseminated intravascular coagulation〔J〕.Throb Haemost，2001;86(5)：1327-30.

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5 Chiang LC，Ng LT，Liu LT，et al.Cytotoxicity and anti-hepatitis B virus activities of saikosaponins from Bupleurum species〔J〕.Plant Med，2003;69(8)：706-9.

6 劉彥琴，陳諭寧，周 凡，等.內(nèi)毒素致大鼠凝血功能改變的實驗研究〔J〕. 中國實用內(nèi)科雜志，2007;27(S1)：108.

7 Leung CY，Liu L，Wong RN，et al.Saikosaponin-d inhibits T cell activation through the modulation of PKCθ，JNK，and NF-κB transcription factor〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2005;338(4)：1920-7.

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