金 冰 趙玉亭 胡述提 (新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453000)

最新多項(xiàng)研究表明，單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)在多種惡性腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)明顯增高，它們的表達(dá)水平與多種實(shí)體惡性腫瘤大小、浸潤深度、淋巴和血管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和國際抗癌聯(lián)盟(UICC)分期密切相關(guān)，與腫瘤生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)移速度密切相關(guān)〔1〕，而有關(guān)MCP-1和MMP-9在賁門癌中的表達(dá)情況還未見有報(bào)道。本研究探討MCP-1和MMP-9在不同組織學(xué)類型、不同分化程度賁門癌組織中的表達(dá)情況及二者的相關(guān)性，尋找可能的賁門癌治療的有效新途徑。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本 選取南陽市中心醫(yī)院2008年7月至2009年7月臨床、病理資料完整的賁門癌切除標(biāo)本51例，每例均取癌灶、淋巴結(jié)，選取癌旁及非賁門癌賁門組織各10例作為對(duì)照組。51例賁門癌中男36例，女15例;年齡35～74歲，中位年齡60歲;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例;按2009版UICC TNM分期〔1〕，Ⅰ+Ⅱ期15例，Ⅲ+Ⅳ期36例;所有病例均經(jīng)蘇木素-伊紅(HE)染色、光鏡下證實(shí)為賁門腺癌，其中乳頭狀腺癌17例，管狀腺癌22例，印戒細(xì)胞癌6例，黏液腺癌6例。所有患者既往均無惡性腫瘤病史，術(shù)前未接受放、化療或其他抗腫瘤治療。

1.2 試劑 兔抗人單克隆抗體MCP-1和MMP-9均購自美國signalway antibodys公司，SP通用型免疫組化試劑盒購于北京博奧森生物技術(shù)公司。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯示增強(qiáng)劑購于北京中杉生物技術(shù)公司。

1.3 方法 手術(shù)標(biāo)本切除后，立即用甲醛固定，24 h內(nèi)取材、石蠟包埋、4 μm連續(xù)切片，采用免疫組化SP法，免疫組化染色按試劑盒操作說明進(jìn)行，兔抗人單克隆抗體MCP-1和MMP-9稀釋濃度均為1∶100。以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗做陰性對(duì)照，已知腫瘤標(biāo)志物做陽性對(duì)照，同時(shí)采用組內(nèi)對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 采用二級(jí)積分法，陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)：根據(jù)陽性細(xì)胞占5個(gè)以上高倍視野比例計(jì)數(shù)，＜5%為0分，5% ～25%為1分，26% ～50%為2分，＞50%為3分。染色強(qiáng)度分類：淡黃色為1分，黃或深黃色為2分，棕色或棕褐色為3分。二者計(jì)分相乘＞1分為陽性。采用雙盲法由兩位病理科醫(yī)師計(jì)分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行χ2檢驗(yàn)及Fisher精確檢驗(yàn)和Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 不同組織MCP-1，MMP-9的表達(dá) 賁門癌組織中MCP-1、MMP-9的表達(dá)率分別是84.3%(43/51)和76.5%(39/51)，均顯高于對(duì)照組〔15%(3/20)，10%(2/20)〕(P ＜0.01)。

2.2 賁門癌組織中MCP-1、MMP-9的表達(dá)與賁門癌臨床病理特征的關(guān)系 賁門癌組織中MCP-1、MMP-9的表達(dá)與腫瘤的TNM臨床分期、病理分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)(P＜0.05)。二者的表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤的病理類型無關(guān)(P＞0.05)。見表1。

表1 MCP-1、MMP-9表達(dá)與賁門癌臨床病理特征的關(guān)系(n)

2.3 賁門癌組織中MCP-1、MMP-9表達(dá)的相關(guān)性 賁門癌組織中MMP-9、MCP-1雙陽性36例，雙陰性5例，僅MMP-9陽性3例，僅MCP-1陽性7例。Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)顯示賁門癌中MCP-1與 MMP-9的表達(dá)呈顯著正相關(guān)性(r=0.396，P＜0.05)。

3 討論

大量的研究報(bào)道，在人體惡性腫瘤組織中有較多巨噬細(xì)胞浸潤，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞浸潤與胃癌患者生存率降低相關(guān);但也有少數(shù)研究報(bào)道巨噬細(xì)胞的數(shù)量較高與較好的預(yù)后相關(guān)〔3〕。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞浸潤程度與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期直接相關(guān)。巨噬細(xì)胞浸潤到腫瘤是由一系列細(xì)胞因子和趨化因子控制的，尤其是MCP-1。MCP-1在許多腫瘤如黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肉瘤、白血病、肝海綿狀血管瘤、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌中都有較高表達(dá)〔4〕。

MCP-1是CC型趨化因子家族成員〔1，2〕，是最有效的巨噬細(xì)胞趨化蛋白之一，影響單核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、堿性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞〔2〕。胃癌細(xì)胞MCP-1表達(dá)與巨噬細(xì)胞浸潤和腫瘤血管密度密切相關(guān)〔3〕。Goede等〔5〕的研究表明 MCP-1能通過招募巨噬細(xì)胞間接誘導(dǎo)血管生成。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞可生產(chǎn)多種血管生成因子，研究表明MCP-1表達(dá)增加了致瘤性。Kuroda等〔6〕通過轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MCP-1在裸鼠模型體內(nèi)的高表達(dá)，可刺激腫瘤新生血管形成，增加正常細(xì)胞癌變的潛在風(fēng)險(xiǎn)。此外，MCP-1可誘導(dǎo)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血性腹水發(fā)生。Nakashima等〔7〕報(bào)道，MCP-1通過增加新血管生成，促進(jìn)鼠結(jié)腸癌肺轉(zhuǎn)移。一些研究發(fā)現(xiàn)，MCP-1增加了體內(nèi)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)。VEGF是促進(jìn)新生血管生成的強(qiáng)效、多功能的細(xì)胞因子，運(yùn)用可能的獨(dú)立的功能作用于血管內(nèi)皮，包括內(nèi)皮細(xì)胞分裂、血管滲透性增加、生成血管活性物質(zhì)和抗內(nèi)皮細(xì)胞凋亡抗體來促進(jìn)新生血管生成。巨噬細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間的相互作用，可能是VEGF生成的一種重要途徑〔3，8〕。本文研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，賁門癌細(xì)胞內(nèi)MCP-1表達(dá)明顯增高，但在癌旁賁門黏膜組織中卻極少表達(dá);同時(shí)，賁門癌間質(zhì)中浸潤的少數(shù)巨噬細(xì)胞也有MCP-1表達(dá)。

MMP-9是一種血管生成因子，使毛細(xì)血管通透性增加，促使腫瘤細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移〔9〕。和許多實(shí)體瘤一樣，賁門癌會(huì)形成新生血管，新的血管生成是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的一個(gè)十分重要的過程。新生血管的生成，一方面有助于提供更多的營養(yǎng)物質(zhì)，滿足腫瘤日益增長(zhǎng)的生長(zhǎng)代謝需求;另一方面還為腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移提供了潛在通路。MMP-9通過各種機(jī)制，包括細(xì)胞外基質(zhì)降解和可能的腫瘤細(xì)胞自身生長(zhǎng)調(diào)節(jié)，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移〔10〕。MMP-9有助于腫瘤壞死因子-α和配體溶解酶的細(xì)胞外釋放，避免癌細(xì)胞接受淋巴誘導(dǎo)的免疫作用而凋亡，在胃癌發(fā)生發(fā)展中作用活躍〔4〕。MMP-9能重塑細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)血管上皮細(xì)胞的遷移〔11〕。VEGF能促進(jìn)血管上皮細(xì)胞增殖并且抑制細(xì)胞凋亡〔12〕。MMP-9和VEGF與胃癌發(fā)生、血管生成、腫瘤細(xì)胞增殖關(guān)系親密。

研究表明，MMP-9在腫瘤的發(fā)生早期即有強(qiáng)烈表達(dá)，并在腫瘤的生長(zhǎng)中發(fā)揮著重要作用。隨著腫瘤浸潤程度的加深、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移站次增高及TNM分期升高，MMP-9在腫瘤組織中的陽性表達(dá)逐漸升高〔9〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明MMP-9的表達(dá)與賁門癌組織的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度密切相關(guān)，而與年齡、性別、病理類型等臨床病理特征無關(guān)，也證實(shí)MMP-9過度表達(dá)與賁門癌浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

綜上所述，MCP-1、MMP-9在可能在賁門癌的發(fā)生、發(fā)展及浸潤、轉(zhuǎn)移過程中起促進(jìn)作用，為賁門癌抗血管生成療法提供了潛在靶點(diǎn)。聯(lián)合檢測(cè)有助于確定賁門癌的惡性程度和估計(jì)預(yù)后，為賁門癌的綜合治療提供有益的幫助;但二者在體內(nèi)聯(lián)系的詳細(xì)分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究加以確定。

1 Zheng HC，Takahashi H，Murai Y，et al.Expressions of MMP-2，MMP-9 and VEGF are closely linked to growth，invasion，metastasis and angiogenesis of gastric carcinoma〔J〕.Anticancer Res，2006;26(5A)：3579-83.

2 Ohta M，Kitadai Y，Tanaka S，et al.Monocyte chemoattractant protein-1 expression correlates with macrophage infiltration and tumor vascularity in human gastric carcinomas〔J〕.Int J Oncol，2003;22(4)：773-8.

3 Hong KH，Ryu J，Han KH.Monocyte chemoattractant protein-1-induced angiogenesis is mediated by vascular endothelial growth factor-A〔J〕.Blood，2005;105(4)：1405-7.

4 Carmeliet P.Angiogenesis in life，disease and medicine〔J〕.Nature，2005;438(7070)：932-6.

5 Goede V，Brogelli L，Ziche M，et al.Induction of inflammatory angiogenesis by monocyte chemoattractant protein-1〔J〕.Int J Cancer，1999;82(5)：765-70.

6 Kuroda R，Ponce ML，Young HA，et al.Human endothelial cells express CCR2 and respond to MCP-1：direct role of MCP-1 in angiogenesis and tumor progression〔J〕.Blood，2000;96(1)：34-40.

7 Nakashima S，Tatsuguchi A，Hiratsuka T，et al.Monocyte chemoattractant protein 1 and CD40 ligation have a synergistic effect on vascular endothelial growth factor production through cyclooxygenase 2 upregulation in gastric cancer〔J〕.J Gastroenterol，2008;43(3)：216-24.

8 Kondo K，Kaneko T，Baba M，et al.VEGF-C and VEGF-A synergistically enhance lymph node metastasis of gastric cancer〔J〕.Biol Pharmaceutical Bull，2007;30(4)：633-7.

9 Rundhaug JE.Matrix metalloproteinases and angiogenesis〔J〕.J Cell Mol Med，2005;9(2)：267-85.

10 Klein G，Vellenga E，F(xiàn)raaije MW，et al.The possible role of matrix metalloproteinase(MMP)-2 and MMP-9 in cancer，e.g.acute leukemia〔J〕.Crit Rev Oncol Hematol，2004;50(2)：87-100.

11 Miyata Y，Kanda S，Nomata K，et al.Expression of metalloproteinase-2，metalloproteinase-9，and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in transitional cell carcinoma of upper urinary tract：correlation with tumor stage and survival〔J〕.Urology，2004;63(3)：602-8.

12 Kaneko T，Konno H，Baba M，et al.Urokinase-type plasminogen activator expression correlates with tumor angiogenesis and poor outcome in gastric cancer〔J〕.Cancer Sci，2003;94(1)：43-9.