曹正余 (云南省第一人民醫(yī)院急診內(nèi)科，云南 昆明 650032)

《中國(guó)高血壓防治指南》(2010版)指出，同型半胱氨酸(Hcy)是一項(xiàng)新的心腦血管疾病危險(xiǎn)因素，并將合并高Hcy血癥的原發(fā)性高血壓定義為H型高血壓〔1〕。近年研究發(fā)現(xiàn)，亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)參與Hcy的代謝過(guò)程〔2〕，編碼該酶的基因在C677T，其基因突變常導(dǎo)致血漿 Hcy水平增高〔3〕。本文探討MTHFR C677T基因突變與老年H型高血壓合并急性心肌梗死(AMI)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇我院收治的H型高血壓合并AMI患者111例，男73例、女38例，平均年齡(73.9±10.2)歲。同期選取在我院住院的單純AMI患者110例，男65例、女45例，平均年齡(75.6±8.6)歲;單純H型高血壓患者112例，男72例、女40例，平均年齡(78.9±7.1)歲;正常健康體檢者148例，男80例、女68例，平均年齡(74.5±8.2)歲。血清 Hcy≥10 μmol/L的原發(fā)性高血壓定義為H型高血壓〔1〕，AMI診斷符合文獻(xiàn)〔4〕的診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除：①有全身系統(tǒng)疾病，如膠原疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、代謝疾病(除外糖尿病)、炎癥、腫瘤、肝臟和腎臟疾病;②非漢族人群，彼此有血緣關(guān)系者。各組性別、年齡等具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 標(biāo)本收集：于患者入院后24 h之內(nèi)抽取晨起空腹肘靜脈血2 ml，乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝，立即置于4℃冰箱中，在1 h內(nèi)4℃離心(3 500 r/min)10 min。檢測(cè)血漿Hcy水平：分離出血漿標(biāo)本至－80℃保存。采用高效液相色譜儀(Agilent 1 200 Infinity，Agilent Technologies)，迪馬 C18 色譜柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm)，熒光探測(cè)儀

(HP1046A，Hewlett Packard)激發(fā)波長(zhǎng)為382 nm、反射波長(zhǎng)為510 nm，流動(dòng)相40 mmol/L醋酸緩沖液(pH4.0)含3%甲醇。質(zhì)控指標(biāo)為美國(guó)Sigma公司提供的Hcy標(biāo)準(zhǔn)品。采用高效液相色譜化學(xué)檢測(cè)法(HPLC-ED)檢測(cè)血漿Hcy濃度。應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀(Hitachi 7060，Hitachi)檢測(cè)總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、血糖、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)等生化指標(biāo)。

1.2.2 MTHFR C677T基因多態(tài)性測(cè)定

1.2.2.1 基因組DNA提取 晨起空腹采肘靜脈血2 ml，加入EDTA抗凝，立即置于 4℃冰箱中，在 1 h內(nèi) 4℃離心(3 500 r/min)10 min。采用血液基因組 DNA提取試劑盒(GENEray，GK1042 100次，中國(guó)上海)提取基因組DNA，并于－20℃保存。使用亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因677C/T檢測(cè)試劑盒(PCR-RFLP法)(MTHFR 677C/T Polymorphism Assay Kit，中國(guó)深圳)進(jìn)行基因分析。實(shí)驗(yàn)用PCR系統(tǒng)為：PCR System 2700，Applied Biosystems，Made in Singapore。

1.2.2.2 PCR擴(kuò)增目的基因片段 特異性擴(kuò)增MTHFR基因含Hinf I限制性酶切位點(diǎn)片段。引物序列如下：P1：5'-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3'，P2：5'-GGACGGTGCGGTGAGAGT G-3'。

1.2.2.3 酶切反應(yīng)條件及結(jié)果鑒定 PCR反應(yīng)體積50 μl，包括含 25 mmol/L MgCl2緩 沖 液 5.0 μl，2.5 mmol/L dNTP 4.0 μl，14 U/μl TaqI 0.2 μl，模板 DNA 5.0 μl，引物 1、2 各20 ng，加 ddH2O 去離子水至 50 μl。反應(yīng)條件：94℃ 30 s，62℃45 s，72℃ 50 s，30 個(gè)循環(huán)周期后 72℃再延伸 10 min，最后 4℃保存。配制2% 瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/ml溴乙啶)，取擴(kuò)增產(chǎn)物 5 μl，加 10 μl ddH2O 及 2 μl溴酚藍(lán)，混合加樣后電泳(電壓110 V，時(shí)間0.5 h)，在紫外燈下觀察擴(kuò)增結(jié)果，拍照記錄可見(jiàn)擴(kuò)增片段大小為198 bp。證實(shí)擴(kuò)增成功后，于擴(kuò)增產(chǎn)物中加入限制性內(nèi)切酶Hinf I酶切反應(yīng)體系20 μl該體系包括擴(kuò)增產(chǎn)物5 μl、10 倍緩沖液 2 μl、Hinf I 1 μl、ddH2O 12 μl。37℃ 消化24 h，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳(電泳條件同上)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用x±s表示，研究對(duì)象的Hardy-Weinberg平衡、各組基因型分布及等位基因頻率等計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料比較用T檢驗(yàn)，多組樣本比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD法，多因素分析采用Logistic回歸。

2 結(jié)果

2.1 各組臨床資料比較 根據(jù)2007年美國(guó)歐洲高血壓學(xué)會(huì)/歐洲心臟病學(xué)會(huì)(ESH/ESC)指南〔6〕，高血壓病診斷標(biāo)準(zhǔn)為收縮壓≥140 mmHg和(或)收縮壓≥90 mmHg，并將高血壓病分為3級(jí)。其中1級(jí)為輕度高血壓，2級(jí)為中度高血壓，3級(jí)為重度高血壓。糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)為：空腹血糖≥7.8 mmol/L或口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L。吸煙史分為現(xiàn)時(shí)吸煙者和不吸煙者(包括于本研究前6個(gè)月戒煙的既往吸煙者)。本研究納入以下三種類型腦卒中〔7〕：包括腦梗死(動(dòng)脈粥樣硬化性血栓性腦梗死)，腔隙性腦梗和腦出血(ICH)。高膽固醇血脂診斷標(biāo)準(zhǔn)為：TG＞1.70 mmol/L或正在服用降膽固醇藥物的患者。與心梗合并“H”型高血壓組比較差異有顯著性。見(jiàn)表1。

2.2 MTHFR基因擴(kuò)增結(jié)果以及基因分型 根據(jù)酶切片段長(zhǎng)度不同分為3種基因型：CC野生型，只含274 bp 1個(gè)片段;CT雜合型，包含274、228、46 bp 3個(gè)片段;TT純合型，包含228、46 bp兩個(gè)片段。46 bp由于片段太小在圖上看不見(jiàn)。見(jiàn)圖1。

2.3 各組MTHFR C677T的基因型和等位基因分布頻率比較

與AMI合并高血壓組比較：1)P＜0.05

2.4 MTHFR C677T基因多態(tài)性與H型高血壓并AMI的關(guān)系多因素回歸分析，控制原發(fā)性高血壓、糖尿病、高脂血癥、腦梗死、高血壓分級(jí)、收縮壓、TG和Hcy水平后，TT基因型是H型高血壓并AMI和單純H型高血壓發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。TT基因型是H型高血壓并AMI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR=1.38，95%CI 1.05～1.79);TT基因型是單純H型高血壓發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR=1.28，95%CI 1.05～1.58)。

表2 各組MTHFR C677T的基因型和等位基因分布頻率比較〔n(%)〕

1，3，8，9，10，11，13 為 CC 基因型;4，5，6，7 為 CT 基因型;2，12 為 TT基因型

3 討論

近年來(lái)，Hcy被認(rèn)為是冠心病致病的一個(gè)新的危險(xiǎn)因素，MTHFR C677T基因突變是導(dǎo)致H型高血壓的主要遺傳因素〔5〕。本研究結(jié)果提示MTHFR可能在老年AMI發(fā)病過(guò)程中具有重要作用。目前關(guān)于MTHFR C677T基因突變是否是老年AMI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素尚不明確。Arruda等〔6〕認(rèn)為C677T突變是動(dòng)脈疾病的危險(xiǎn)因素。本研究結(jié)果與上述報(bào)道一致。但也有研究認(rèn)為該基因突變并非冠心病的危險(xiǎn)因素〔7〕，有Meta分析表明，雖然MTHFR C677T基因突變是導(dǎo)致高Hcy血癥的主要因素，但是該基因多態(tài)性并未增加心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)〔8〕。

有報(bào)道稱當(dāng)MTHFR基因突變時(shí)，酶活性降低并影響葉酸的活化，從而導(dǎo)致Hcy水平升高〔2〕。Hcy作為動(dòng)脈粥樣硬化的一個(gè)獨(dú)立的危險(xiǎn)因素已得到廣泛認(rèn)同，它可以導(dǎo)致內(nèi)皮功能損傷，提高氧化應(yīng)激，促使血管平滑肌的增生。一項(xiàng)涉及16 849例病例的Meta分析表明，血漿Hcy每增加5 μmol/L，發(fā)生心血管病的危險(xiǎn)性增加1.65倍〔9〕。

血漿Hcy代謝復(fù)雜，受到遺傳和環(huán)境的多重影響，MTHFR只影響到其代謝途徑之一。在某些特殊情況，如葉酸攝入過(guò)低時(shí)，MTHFR基因突變才成為主要矛盾影響Hcy代謝〔10〕。2011年一項(xiàng)Meta分析發(fā)現(xiàn)，低葉酸攝入的亞洲人群中TT基因型比CC基因型Hcy水平升高3.12 μmol/L;表明在低葉酸攝入人群中MTHFR C677T突變導(dǎo)致的高Hcy血癥的風(fēng)險(xiǎn)更大〔11〕。本研究對(duì)象為中國(guó)漢族人群，為低葉酸攝入人群，故更易得出MTHFR C677T突變導(dǎo)致心血管事件的結(jié)論，可能存在一定結(jié)果偏移，若能加入高葉酸攝入人群進(jìn)行對(duì)比，則更用利于消除研究人群帶來(lái)的選擇偏移。

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