蔡 郁 蔡 敏 王文華 張步勇 徐艷萍 (吉林大學(xué)第二醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，吉林 長春 130041)

喉癌是我國北方地區(qū)常見的惡性腫瘤，發(fā)病率占頭頸腫瘤的15%～20%，由于其發(fā)病部位受生理解剖特點(diǎn)的影響，手術(shù)很難徹底切除病灶，因此，非手術(shù)的綜合治療近年來倍受關(guān)注。熱療作為治療手段之一，因其毒副作用反應(yīng)低，與放療、化療等有協(xié)同作用，不僅用于無法手術(shù)切除的腫瘤患者，而且還可以用于腫瘤切除術(shù)中或術(shù)后治療微小轉(zhuǎn)移灶〔1〕。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑 Hep -2細(xì)胞株由吉林省腫瘤研究所惠贈，噻唑藍(lán)(MTT)試劑及RPMI1640培養(yǎng)基購于美國sigma公司，胎牛血清購于長春生物制品研究所，5-氟尿嘧啶(5-FU)廣州振康醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)。

1.2 MTT比色法 取對數(shù)生長期的人喉癌細(xì)胞株Hep-2細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞數(shù)為2×105/ml，接種于96孔塑料培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100 μl，當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到80%匯合時分組。單純熱療組43℃ ±0.2℃持續(xù)加熱40 min，然后移入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng);單純5-FU組，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，5-FU最適濃度200 μg/ml。聯(lián)合組在單純5-FU組基礎(chǔ)上再加熱40 min，然后移入37℃CO2培養(yǎng)箱靜止培養(yǎng)24 h，于結(jié)束前6 h加入MTT試劑20 μl/孔，終濃度為500 mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，吸棄上清，加入二甲基亞砜150 μl/孔，震蕩10 min，用酶標(biāo)儀于570 nm處測量各孔吸光度A值，按下列公式計算Hep-2細(xì)胞增殖抑制率，Hep-2細(xì)胞抑制率=(1－加藥孔細(xì)胞A值÷對照孔細(xì)胞A值)×100%。

1.3 流式細(xì)胞術(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)及分組同1.2，不同之處是將96孔板改為25 ml培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)結(jié)束后細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，70%冷乙醇固定，上機(jī)前過40目網(wǎng)調(diào)細(xì)胞數(shù)1×106/ml，碘化丙啶(PI)染色，流式細(xì)胞儀檢測，以Modifi2.0軟件分析細(xì)胞周期。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以表示，組間比較采用F檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果 不同條件對Hep-2細(xì)胞增殖抑制率均有影響，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比差異顯著，尤以聯(lián)合組效果最佳。見表1。

表1 不同條件下Hep-2細(xì)胞增殖抑制率

表1 不同條件下Hep-2細(xì)胞增殖抑制率

組別 A值 抑制率(%) P值對照組1.42±0.12 － －單純熱療組 1.24±0.16 13.7 ＜0.01單純5-FU組 1.09±0.19 22.3 ＜0.01聯(lián)合組0.76±0.15 46.5 ＜0.01

2.2 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果 不同條件對Hep-2細(xì)胞周期各時相均有影響，阻滯G1期細(xì)胞向S期轉(zhuǎn)化，從而使G2/M期細(xì)胞相對增多，凋亡率(AP)升高。見表2。

表2 不同條件下Hep-2細(xì)胞周期進(jìn)程及凋亡率

表2 不同條件下Hep-2細(xì)胞周期進(jìn)程及凋亡率

與對照組比較：1)P ＜0.05，2)P ＜0.01

對照組33.5±2.1 63.7±3.1 2.4±1.9 1.5單純熱療組 45.8±4.21) 42.1±4.81) 12.8±1.91) 7.52)單純5-FU組 52.6±4.41) 27.7±3.21) 19.4±3.22) 13.82)聯(lián)合組 61.6±3.72) 13.8±2.32) 24.5±3.52) 17.52)

3 討論

近年來，熱療因其安全有效而逐漸成為繼手術(shù)、放療、化療及生物治療后又一腫瘤治療手段〔2〕，被國際抗癌組織稱之為腫瘤“綠色療法”。新近研究表明，熱療配合放療或化療可顯著提高腫瘤的局部控制率及患者的生存率。5-FU為一線抗腫瘤藥物，在體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)榉蜞奏っ撗鹾塑账崤c胸腺嘧啶核苷酸酶特異性結(jié)合，影響細(xì)胞DNA的合成〔3〕，阻滯G1期細(xì)胞向S期轉(zhuǎn)化，從而造成G1期細(xì)胞堆積，不能進(jìn)入S期。此外，由于S期細(xì)胞對熱敏感〔4〕，受熱后損傷嚴(yán)重，可形成多核細(xì)胞，分裂后死亡。熱療也是導(dǎo)致S期細(xì)胞減少的主要因素，根據(jù)流式細(xì)胞儀結(jié)果可以初步認(rèn)為熱療與5-FU聯(lián)合應(yīng)用既能抑制細(xì)胞周期G1期的進(jìn)程，又能抑制S期細(xì)胞，從而使G2/M期細(xì)胞相對增多。G2/M期是細(xì)胞增殖的重要階段，多種DNA損傷劑(如射線、化療藥物等)都可以引起G2/M期阻滯〔5〕。由于G2/M期阻滯在細(xì)胞增殖和凋亡中的作用，使人們聯(lián)想到它可能與細(xì)胞基因組不穩(wěn)定、腫瘤發(fā)生和治療密切相關(guān)。

綜上所述，熱療具有直接的細(xì)胞毒作用，可使細(xì)胞膜的通透性和流動性改變，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變〔6〕，熱療和化療聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同作用，熱療增加細(xì)胞膜的通透性，有利于抗腫瘤藥物吸收;此外，熱療改變了藥物的藥代動力學(xué)，從而使腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物攝取量增加，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或死亡。

1 高 慧，楊耀琴.熱療與生物治療的聯(lián)合抗腫瘤效應(yīng)〔J〕.國際腫瘤學(xué)雜志，2009;36(3)：193-5.

2 郝麗莉，盛延良，王淑秋，等.腫瘤熱療的研究進(jìn)展〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008;8(4)：772-4.

3 盛雅萍，郭偉劍.5-氟尿嘧啶耐藥機(jī)制及其治療〔J〕.國際腫瘤學(xué)雜志，2006;33(7)：502-5.

4 Martin LG，Demers GW，Galloway DW.Disruption of the G1/S transition in human Papilloma-virus type16 E7-expressing human cells in associated regulation of cyclin E〔J〕.J Virol，1998;72(2)：975-85.

5 Eillnger-Ziegelbauer H，Karasuyama H，Yamada E，et al.Ste20-like kinase(SLK)，a regulatory kinase for polo-like kinase(PLK)during the G2/M transition in somatic cells〔J〕.Genes Cells，2000;5(6)：491-8.

6 Jie KG，Jiang H，Sun L，et al.The pilot study of anti-tumor effects versus immunosuppression of Staphylococcal Enterotoxin C〔J〕.Cancer Biol T-her，2007;6(10)：1584-91.