郭 冉，劉潔婷，吳 丹，劉海峰，初彥輝

(牡丹江醫(yī)學(xué)院 1.生理教研室，2.黑龍江省抗纖維化生物治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 牡丹江 157011)

重組人轉(zhuǎn)化生長因子β1原核表達(dá)及多克隆抗體制備

郭 冉1，劉潔婷2，吳 丹2，劉海峰2，初彥輝2

(牡丹江醫(yī)學(xué)院 1.生理教研室，2.黑龍江省抗纖維化生物治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 牡丹江 157011)

目的 克隆人轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)基因，原核表達(dá)TGF-β1蛋白，制備兔抗人TGF-β1多克隆抗體。方法 應(yīng)用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增人TGF-β1基因序列，構(gòu)建pET-28a-TGF-β1重組質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)中，異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)。Western-blot檢測目的蛋白的抗原性。免疫新西蘭白兔，獲得兔抗人TGF-β1多克隆抗血清。飽和硫酸銨鹽析法純化多克隆抗體，間接ELISA法檢測多克隆抗體效價，Westernblot技術(shù)進(jìn)行抗體特異性檢測。結(jié)果 獲得了TGF-β1編碼序列和表達(dá)載體，目的蛋白主要存在于超聲破碎后的包涵體中;經(jīng)Western-blot檢測目的蛋白存在抗原性;獲得純化的兔抗人多克隆抗體效價達(dá)1∶10 000。結(jié)論 獲得的兔抗人TGF-β1多克隆抗體效價較高，具有良好的特異性。

轉(zhuǎn)化生長因子β1;抗纖維化;原核表達(dá);多克隆抗體

轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)對瘢痕成纖維細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)起到主要的調(diào)控作用并參與瘢痕形成中的調(diào)節(jié)活動，目前研究最為廣泛［1-2］。TGF-β被認(rèn)為是促進(jìn)纖維化發(fā)展的最重要的生長因子［3］。在創(chuàng)傷中TGF-β1的表達(dá)增加，同時還能刺激成纖維細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性TGF-β1，甚至加入外源性的 TGF-β1可以增加創(chuàng)傷中膠原纖維蛋白和炎性細(xì)胞的數(shù)量［4-5］。正反饋刺激作用 TGF-β1可加速體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩細(xì)胞增殖和分裂并促進(jìn)膠原的基因表達(dá)和蛋白合成

陳永平等［7］曾提出將 TGF-β1構(gòu)建為疫苗，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，中和體內(nèi)產(chǎn)生的過量的TGF-β1。相關(guān)文獻(xiàn)報道，抗TGF-β1抗體具有中和TGF-β1活性的作用［8］，anti-TGF-β1抗體能明顯抑制成纖維細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，能抑制成纖維細(xì)胞的增殖和膠原合成［9］。

本實(shí)驗(yàn)通過原核表達(dá)TGF-β1蛋白，以該蛋白作為抗原，在動物體內(nèi)制備多克隆抗血清，并檢測該抗體的特異性，為進(jìn)一步研究TGF-β1與纖維化的關(guān)系提供相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

載體 pET-28a、E.coli DH5α、E.coli BL21 菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存;引物序列遞交上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成;Trizol Reagent為Invitrogen公司產(chǎn)品;逆轉(zhuǎn)錄酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶及Pfu DNA聚合酶均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;BCA蛋白定量試劑盒購于蓋寧生物科技(北京)有限公司;UPS-蛋白質(zhì)銀染試劑盒由溫州安得森生物科技有限公司惠贈;兔抗-TGFβ1抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

雄性新西蘭白兔3只購自黑龍江省中醫(yī)藥大學(xué)動物中心。

2 方法

2.1 TGF-β1 基因的構(gòu)建

參照Gene bank數(shù)據(jù)庫提供的人TGF-β1的cDNA序列設(shè)計引物，為方便克隆在上下游引物的5'端分別加入NdeⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)。

引物序列:5'GATGGGAATTCCATATGGCCCTGGACACCAACTATTG3'

5'ACTGCCCAAGCTTGCTGCACTTGCAGGAGCG3'

采用Trizol Reagent試劑抽提人血中總RNA，RT-PCR 方法逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA［10］。

2.2 TGF-β1 表達(dá)載體的構(gòu)建

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠分離，回收的基因與載體pET-28a質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切，用T4連接酶進(jìn)行連接，得到pET-28a-TGF-β1重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至 E.coli DH5α，對重組子進(jìn)行酶切鑒定，陽性克隆進(jìn)行測序。

2.3 TGF-β1 蛋白的表達(dá)

將測序正確的重組基因轉(zhuǎn)化至E.coli BL21中，得到表達(dá)菌株 pET-28a-TGF-β1/BL21，異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)。離心收集菌體。菌體重懸于磷酸鹽緩沖液(PBS)30 mL中。冰浴下，超聲破碎重懸菌。包涵體復(fù)性處理。取復(fù)性后透析后液體進(jìn)行SDS-PAGE分析。應(yīng)用常規(guī)方法測定復(fù)性后目的蛋白濃度［11］。Western blot檢測蛋白抗原性。

2.4 多克隆抗體的制備

取復(fù)性后的蛋白和等體積弗氏完全佐劑充分乳化，皮下多點(diǎn)注射新西蘭白兔，每只用量為0.5 mg;14 d后用弗氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫1次。共加強(qiáng)免疫3次，后兩次加強(qiáng)免疫直接靜脈注射不含佐劑的抗原0.5 mg。第21天開始耳緣靜脈取血檢測效價，末次免疫7 d后頸總動脈采血收集抗血清，分裝后－80℃保存。

2.5 多克隆抗體的純化

采用飽和硫酸銨鹽析沉淀法純化抗體［12］。①取兔血清10 mL與等體積生理鹽水混合后，于攪拌下緩慢滴加SAS(飽和硫酸銨溶液)20 mL，于4℃緩慢攪拌3～4 h，使蛋白充分沉淀;②4℃，3 000 r/min離心30 min，棄上清，用生理鹽水6 mL溶解沉淀，緩慢滴加SAS 4 mL，4℃緩慢攪拌1 h;③重復(fù)②;④4℃離心，用生理鹽水6.7 mL溶解沉淀，滴加SAS 3.3 mL，4℃緩慢攪拌1 h;⑤重復(fù)④;⑥4℃離心，用10 mmoL/L PBS(pH 7.4)2 mL 溶解沉淀，PBS透析，更換3次PBS，4℃緩慢搖動過夜，得到抗血清，分裝后置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6 檢測多克隆抗體的效價

間接ELISA法檢測純化后多抗兔血清效價，10 mmoL/L PBS倍比稀釋(1∶200 ～1∶25 600)多抗血清，同時取免疫前血清1∶500稀釋，作為陰性對照。每組3個復(fù)孔。

2.7 SDS-PAGE、Western blot檢測抗體

取純化后的抗血清，進(jìn)行SDS-PAGE檢測，確定純化后抗血清中免疫球蛋白的含量以及純化的效果。取未誘導(dǎo)的空菌及復(fù)性后的TGF-β1蛋白10 μL，以純化后的兔抗人TGF-β1多克隆抗體作為一抗(1∶10 000)，以HRP標(biāo)記的羊抗兔酶標(biāo)抗體作為二抗進(jìn)行Western blot檢測抗體的特異性。

3 結(jié)果

3.1 TGF-β1 基因構(gòu)建

利用RT-PCR方法，以人外周血cDNA為模板，擴(kuò)增TGF-β1基因。如圖1所示，其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為360 bp，與實(shí)驗(yàn)設(shè)計一致。

3.2 TGF-β1 表達(dá)載體的構(gòu)建

陽性克隆質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和HindⅢ雙酶切進(jìn)行鑒定。結(jié)果如圖2所示。獲得的目的片段大小與實(shí)際相符。陽性克隆重組質(zhì)粒遞交中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司進(jìn)行序列測定，測序結(jié)果表明插入序列和通讀框均正確。

圖1 TGF-β1基因片段的PCR擴(kuò)增Fig.1 The PCR production of TGF-β1 gene fragment

圖2 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.2 Identification of pET-28a-TGF-β1 recombinant plasmid using double digests method

3.3 TGF-β1 蛋白的表達(dá)

經(jīng)12%SDS-PAGE檢測，目的蛋白主要存在于包涵體中。測定復(fù)性后目的蛋白濃度為3.5 mg/mL。SDS-PAGE檢測結(jié)果如圖3所示。約16 kD的位置上出現(xiàn)特異條帶，符合目的蛋白理論推算值。

圖3 SDS-PAGE分析TGF-β1表達(dá)Fig.3 SDS-PAGE analysis for the expression and purity of TGF-β1 protein

3.4 Western blot檢測目的蛋白的抗原性

一抗為兔抗人TGF-β1多抗，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，結(jié)果如圖4，經(jīng)過比對確定，在約16 kD處顯示單一條帶，證實(shí)經(jīng)純化后的TGF-β1蛋白具有抗原性，可以應(yīng)用于下一步抗體的制備。

圖4 免疫印跡分析TGF-β1蛋白Fig.4 Western-blot analysis for the TGF-β1 protein

3.5 多克隆抗體效價測定

SAS鹽析沉淀法純化抗體，間接ELISA方法檢測抗體效價，純化后抗體效價達(dá)1∶12 800。純化后的抗血清經(jīng)還原型SDS-PAGE檢測，結(jié)果如圖5，主要蛋白條帶在約50 kD位置，符合兔IgG基本特征，另外，在20 kD左右出現(xiàn)較彌散的條帶，為IgG輕鏈分子。

圖5 SDS-PAGE分析多克隆抗體Fig.5 SDS-PAGE analysis for polyclonal antibody

3.6 Western blot檢測抗體

以純化后的多克隆抗體作為一抗，與未誘導(dǎo)空菌及復(fù)性后的 TGF-β1蛋白進(jìn)行Western blot免疫印跡分析，結(jié)果如圖6所示。結(jié)果表明，多克隆抗血清與TGF-β1目的蛋白分子質(zhì)量位置發(fā)生反應(yīng)，說明制備的多克隆抗體能與目的蛋白特異性結(jié)合。

4 討論

抗TGF-β1抗體，作為TGF-β1有效的拮抗劑，能競爭性抑制TGF-β1與其受體結(jié)合，阻斷其生物活性，從而避免或者減輕TGF-β1對機(jī)體產(chǎn)生的不利影響，并對各種器官的纖維化治療起到一定的作用。一些研究TGF-β與瘢痕形成的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用抗TGF-β抗體可能會減輕瘢痕。

目前，對TGF-β抗體的研究多為體外實(shí)驗(yàn)，且TGF-β抗體成品比較昂貴，使其應(yīng)用受到限制。本實(shí)驗(yàn)以原核表達(dá)獲得的TGF-β1蛋白作為抗原，在動物體內(nèi)制備多克隆抗血清。經(jīng)飽和硫酸銨鹽析法純化后，間接 ELISA檢測多克隆抗體效價達(dá)1∶10 000以上。SDS-PAGE 分析及 Western blot檢測，本研究所獲得的兔抗人TGF-β1多克隆抗體純度較高，能與TGF-β1目的蛋白特異性結(jié)合。為進(jìn)一步研究與TGF-β1密切相關(guān)的疾病，特別是抗纖維化的研究提供了有利條件，奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

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Recombinant human TGF-β1 prokaryotic expression and polyclonal antibody preparation

GUO Ran1，LIU Jie-ting2，WU Dan2，LIU Hai-feng2，CHU Yan-hui2
(Mudanjiang Medical University，1.Department of Physiology，Heilongjiang Key Laboratory of Anti-fibrosis Biotherapy，Mudanjiang 157011，China)

Purpose To clone human TGF-β1 gene and prokaryotic expression of TGF-β1 protein through the expression of this gene，and then to get the rabbit-anti-human TGF-β1 polyclonal antibody from the immune rabbit with this protein.Methods Using RT-PCR technique to amplified human TGF-β1 gene sequence.Then the target gene was cloned into a prokaryotic expression vector pET-28a by using the recombinant DNA technique.After induced by IPTG，the protein TGF-β1 was expressed in E.coli BL21(DE3).The protein testified its antigenicity by Western-blot.Next，we immunized New Zealand white rabbits with the obtained recombinant protein as antigen.We collected the immune sera of rabbit.Then purified antibody by ammonium sulfate fractionationthen，the indirect Enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect the polyclonal antibodies titer.Western-blot techniques were used to identify antibody specificity.Results The encoding sequence and expression vector of TGF-β1 was obtained while the interest protein was mainly expressed in the inclusion body.Western-blot detection of the target protein displays antigenicity.The purified rabbit anti-human polyclonal antibodies titer is 1∶10 000.Conclusion The rabbit anti-human TGF-β1 polyclonal antibodies titer is higher and has a better specificity.

TGF-β1;anti-fibrosis;prokaryotic expression;polyclonal antibody

Q78

A

1005-1678(2012)04-0354-04

2011-09-16

黑龍江省自然基金(D2007-99);黑龍江省高等教育學(xué)會高等教育科學(xué)研究“十一五”規(guī)劃課題(開放省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室對創(chuàng)新人才培養(yǎng)的改革與探索)

郭 冉，男，碩士，助教，E-mail:guoran1980@sina.com;初彥輝，男，通信作者，教授，碩士生導(dǎo)師，Tel:0453-6984634，E-mail:yanhui_chu@sina.com。