盧雪梅，金小寶，朱家勇

(1.廣東藥學(xué)院 藥用生物活性物質(zhì)研究所，2.廣東省生物活性藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006)

新型抗菌蛋白天蠶素-人溶菌酶在大腸桿菌中的表達(dá)條件優(yōu)化及純化

盧雪梅1，2，金小寶1，2，朱家勇1，2

(1.廣東藥學(xué)院 藥用生物活性物質(zhì)研究所，2.廣東省生物活性藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006)

目的 探討重組家蠅天蠶素-人溶菌酶(Mdc-hly)在大腸桿菌中的表達(dá)條件及純化。方法 利用SDSPAGE電泳和BandScan凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)研究誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、異丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)融合蛋白表達(dá)的影響。融合蛋白經(jīng)His瓊脂糖柱親和色譜純化后，Western blot鑒定。結(jié)果 在起始菌濃度為A600=0.6時(shí)加入濃度為1.0 mmol/L的IPTG，37℃誘導(dǎo)6 h，融合蛋白的表達(dá)量最高，占菌體總蛋白的39.1%。純化后融合蛋白純度可達(dá)95%，Western blot鑒定為目的蛋白。結(jié)論 確定了重組融合蛋白的最佳表達(dá)條件，并純化了目的蛋白。

家蠅天蠶素;溶菌酶;重組融合蛋白;表達(dá)條件;純化

由于環(huán)境的改變和微生物的適應(yīng)性進(jìn)化，細(xì)菌耐藥性已成為影響公眾健康的嚴(yán)重問(wèn)題，人們不斷地去研究、開(kāi)發(fā)新型抗菌藥物來(lái)對(duì)付耐藥菌，其中肽類抗菌物質(zhì)如溶菌酶、天蠶素等成為近年研究熱點(diǎn)。溶菌酶可以破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌具有較強(qiáng)的殺菌活性［1］。天蠶素是一類具有廣譜抗菌活性的抗菌肽，主要作用于細(xì)菌的細(xì)胞膜［2-4］。雖然溶菌酶、天蠶素等在耐藥性問(wèn)題日益嚴(yán)重的情況下顯示出了良好的應(yīng)用前景，然而與傳統(tǒng)抗生素相比，目前所發(fā)現(xiàn)的肽類抗菌物質(zhì)抗菌活性還不夠理想，如天蠶素類抗菌肽對(duì)不同細(xì)菌的殺滅能力并非完全相同;溶菌酶的抗菌譜還不廣泛，若單獨(dú)使用對(duì)革蘭陰性菌的抑制作用并不明顯等。研究發(fā)現(xiàn)天蠶素能顯著加強(qiáng)溶菌酶抗菌活性 ，推測(cè)可能是天蠶素破壞細(xì)菌外膜后利于溶菌酶作用于細(xì)胞壁。因此，本課題組首次提出將家蠅天蠶素與人溶菌酶構(gòu)建成新型抗菌融合蛋白的設(shè)想，期望二者作用機(jī)制得到互補(bǔ)，發(fā)揮其綜合效應(yīng)，從而降低細(xì)菌的耐藥機(jī)率。

前期研究中，我們將家蠅天蠶素與人溶菌酶基因進(jìn)行了融合，并成功構(gòu)建了重組原核表達(dá)質(zhì)粒［7］。在此基礎(chǔ)上，本研究通過(guò)優(yōu)化外源基因在大腸桿菌中表達(dá)的幾個(gè)重要因素:誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)起始菌濃度、異丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)濃度和誘導(dǎo)時(shí)間，以期確立目的蛋白高效表達(dá)的最佳條件，并通過(guò)親和色譜純化目的蛋白，為進(jìn)一步研究重組家蠅天蠶素-人溶菌酶(Mdc-hly)的生物學(xué)活性及產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株

含有pET-32a/Mdc-hly的Escherichia coli BL21(DE3)，由本所構(gòu)建并保存。

1.2 主要試劑

蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，MBI生物公司;TEMED，北京鼎國(guó)生物公司;丙烯酰胺、N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺、咪唑、過(guò)硫酸胺，Sigma公司;HisTrap Kit，德國(guó)GE healthcare公司;6×His Tag小鼠單克隆抗體、山羊抗小鼠IgG HRP標(biāo)記的抗體，美國(guó)Pharmacia公司;DAB顯色試劑盒，武漢博士德公司。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)

將含有pET32a/Mdc-hly的 E.coli BL21(DE3)接種于含100μg/mL氨芐西林的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單個(gè)克隆，接種于LB液體培養(yǎng)基5 mL中，37℃，170 r/min振蕩培養(yǎng)12～16 h。

1.4 不同誘導(dǎo)溫度對(duì)目的蛋白表達(dá)量的影響

以1%接種量將過(guò)夜培養(yǎng)菌液接種于含100 μg/mL氨芐西林的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至A600在0.6左右，加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，誘導(dǎo)溫度分別為37，34，31和28℃。誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h后離心，收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE，BandScan凝膠電泳分析系統(tǒng)分析目的蛋白的表達(dá)量。

1.5 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)目的蛋白表達(dá)量的影響

細(xì)菌培養(yǎng)方法同1.3項(xiàng)，分別在起始菌濃度A600為 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 和 2.0 時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h，取樣進(jìn)行SDS-PAGE，BandScan凝膠電泳分析系統(tǒng)分析目的蛋白的表達(dá)量。

1.6 不同濃度IPTG對(duì)目的蛋白表達(dá)量的影響

細(xì)菌培養(yǎng)方法同1.3項(xiàng)，當(dāng)A600為0.6時(shí)，分別加入 IPTG 至終濃度為 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 和1.2 mmol/L，37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h后，取樣進(jìn)行SDSPAGE，BandScan凝膠電泳分析系統(tǒng)分析目的蛋白的表達(dá)量。

1.7 不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)目的蛋白表達(dá)量的影響

細(xì)菌培養(yǎng)方法同1.3項(xiàng)，當(dāng)A600在0.6時(shí)，加入IPTC 至終濃度為1.0 mmol/L，37 ℃振蕩培養(yǎng)2，4，6，8，10和12 h。離心收菌，取樣進(jìn)行SDS-PAGE，Band-Scan凝膠電泳分析系統(tǒng)分析目的蛋白的表達(dá)量。

1.8 融合蛋白的純化與鑒定

將誘導(dǎo)表達(dá)的培養(yǎng)物離心，收集菌體加入細(xì)菌裂解液重懸菌體，冰浴超聲破菌，離心收集沉淀。用包涵體溶解液(50 mmol/L Tris-HCl緩沖液，含尿素8 mmol/L，pH 8.0)溶解，離心取上清。由于誘導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白帶有6×His標(biāo)簽，能與HisTrapTMHP親和色譜柱上6×His配體特異性結(jié)合而掛在柱子上，其他雜蛋白不能與親和色譜柱結(jié)合而穿透，從而達(dá)到分離純化的效果。按照HisTrapTMHP說(shuō)明書(shū)操作，吸取上清過(guò)預(yù)平衡后的親和柱，洗去結(jié)合的非特異性蛋白，再分別用含100，300，500 mmol/L咪唑的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗脫目的蛋白，分段收集洗脫液，取樣進(jìn)行SDS-PAGE。

純化產(chǎn)物經(jīng)15%SDS-PAGE蛋白電泳后，通過(guò)半干電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)印至PVDF(Polyvinylidene difluoride)膜上，5%脫脂牛奶封閉液中室溫封閉2 h，TBST漂洗(10 min×3)后放入用TBST按1∶1 000稀釋的鼠源抗6×His一抗溶液中，4℃過(guò)夜，TBST漂洗(10 min×3)后，與 HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG抗體(1∶2 000)室溫孵育1 h，用DAB顯色系統(tǒng)顯色，檢測(cè)分析Western blot結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 不同誘導(dǎo)溫度對(duì)目的蛋白表達(dá)量的影響

15%SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示在約38 kD(因載體pET32a具有Trx標(biāo)簽蛋白，分子質(zhì)量約為18 kD，而Mdc-hly分子質(zhì)量約為20 kD，因此表達(dá)的蛋白應(yīng)是大約38 kD)處出現(xiàn)蛋白條帶，而未誘導(dǎo)的培養(yǎng)物中未出現(xiàn)特異性條帶。在37，34，31和28℃誘導(dǎo)條件下，均有目的蛋白表達(dá)，目的蛋白表達(dá)量分別為細(xì)菌總蛋白的 38.1%，36.2%，30.7% 和 27.6%，可見(jiàn)37℃時(shí)，目的蛋白的表達(dá)量最高(圖1)。

2.2 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)目的蛋白表達(dá)量的影響

菌體濃度 A600為 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 和 2.0時(shí)，目的蛋白表達(dá)量分別為細(xì)菌總蛋白的30.1%，33.9%，38.5%，38.4%，35.2% 和 33.6%?？梢?jiàn)在其它條件相同的情況下，以A600值為0.6時(shí)開(kāi)始誘導(dǎo)表達(dá)效果最好(圖2)。

圖1 誘導(dǎo)溫度對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的影響Fig.1 Effect of temperature on the expression level in E.coli BL21/pET-32a-Mdc-hly

圖2 不同菌密度A600對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的影響Fig.2 Effect of cell density on the expression level in E.coli BL21/pET-32a-Mdc-hly

2.3 不同IPTG誘導(dǎo)濃度對(duì)目的蛋白表達(dá)量的影響

IPTG 終濃度為 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 和 1.2 mol/L時(shí)，目的蛋白表達(dá)量分別為細(xì)菌總蛋白的18.7%，26.5%，32.6%，36.7%，38.7% 和 37.2%。可見(jiàn)IPTG在較低濃度時(shí)就可啟動(dòng)目的基因的高效表達(dá)，且目的蛋白表達(dá)量隨著IPTG濃度的升高而升高，濃度為1.0 mmol/L時(shí)表達(dá)量最高;而IPTG濃度提高到1.2 mmol/L時(shí)，表達(dá)量反而有所下降(圖3)。

2.4 不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)目的蛋白表達(dá)量的影響

誘導(dǎo)時(shí)間為2，4，6，8，10 和 12 h 時(shí)，目的蛋白表達(dá)量分別為細(xì)菌總蛋白的 31.7%，36.5%，39.1%，38.9%，38.4% 和 37.4%?？梢?jiàn)目的蛋白的表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間的增加而逐漸增加，至6 h時(shí)目的蛋白表達(dá)量最高(圖4)。

圖3 IPTG濃度對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的影響Fig.3 Effect of IPTG concentration on the expression level in E.coli BL21/pET-32a-Mdc-hly

圖4 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的影響Fig.4 Effect of post-induction timing on the expression level in E.coli BL21/pET-32a-Mdc-hly

2.5 融合蛋白的純化與鑒定

純化洗脫液經(jīng)15%SDS-PAGE蛋白電泳，結(jié)果見(jiàn)圖5，BandScan軟件分析結(jié)果顯示500 mmol/L咪唑溶液洗脫可得到純度為95%的融合蛋白。Western blot分析結(jié)果顯示，在分子質(zhì)量為38 kD處有一特異清晰條帶，而未誘導(dǎo)對(duì)照則沒(méi)有(圖6)，說(shuō)明本研究成功地表達(dá)純化了目的蛋白，且在此過(guò)程中融合蛋白沒(méi)有發(fā)生降解現(xiàn)象。

3 討論

肽類抗菌物質(zhì)至今未能得到廣泛應(yīng)用，主要原因之一是其來(lái)源困難，無(wú)法大量低成本獲得。天然提取資源有限，工藝復(fù)雜，成本昂貴;化學(xué)合成肽類則成本太高，產(chǎn)業(yè)化困難;通過(guò)基因工程技術(shù)表達(dá)成本較低的抗菌活性蛋白則是國(guó)內(nèi)外學(xué)者追求的可持續(xù)手段。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是基因表達(dá)技術(shù)中發(fā)展最早，應(yīng)用最為廣泛的經(jīng)典表達(dá)系統(tǒng)，是生物技術(shù)研究和生物藥物產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程中的重要工具。優(yōu)化表達(dá)條件的主要目的是盡可能提高目的蛋白的表達(dá)量，降低生產(chǎn)成本。但是外源基因在宿主菌中高效表達(dá)，必然影響細(xì)菌本身的生長(zhǎng)和代謝，而細(xì)菌代謝受到影響又必然反過(guò)來(lái)影響外源基因的表達(dá)。如何合理地調(diào)節(jié)好宿主菌的代謝負(fù)荷與外源基因高效表達(dá)的關(guān)系，是提高外源基因表達(dá)不可缺少的一個(gè)環(huán)節(jié)。

在本研究中，我們采用了宿主菌的生長(zhǎng)與誘導(dǎo)分階段進(jìn)行，在誘導(dǎo)階段采用ITPG的誘導(dǎo)措施。影響外源蛋白表達(dá)的因素很多，除了質(zhì)粒和宿主菌的因素外，培養(yǎng)條件(如誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)菌體起始濃度、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)間)也至關(guān)重要，通過(guò)對(duì)這些因素的優(yōu)化，可以提高目的蛋白的產(chǎn)量。由本研究可知，優(yōu)化培養(yǎng)條件可以有效提高目的蛋白的表達(dá)量，在最適宜的條件(誘導(dǎo)溫度為37℃、起始菌濃度為 A600=0.6、IPTG 濃度為 1.0 mmol/L、誘導(dǎo)時(shí)間為6 h)下，融合蛋白占全菌總蛋白的39.1%。

親和色譜是指利用蛋白質(zhì)、多肽與某些配基的特異性相互作用而進(jìn)行分離。本研究選用的融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)的目的蛋白帶有6個(gè)組氨酸殘基可以特異性地結(jié)合固定化金屬離子Ni2+，所以可用嚴(yán)格的條件輕易的洗掉雜質(zhì);而目標(biāo)蛋白可通過(guò)咪唑的競(jìng)爭(zhēng)被溫和的洗脫。此外，這種相互作用不受蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，所以即使在溶解包涵體所需的強(qiáng)變性條件下也能進(jìn)行帶6×His標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白純化。本研究采用HisTrapTMHP親和色譜柱對(duì)融合蛋白對(duì)行純化，并對(duì)純化條件進(jìn)行了初步探索，獲得了一定量純度較高的目的蛋白，這為進(jìn)一步研究新型抗菌融合蛋白Mdc-hly的生物學(xué)活性及產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)奠定了必要的基礎(chǔ)。

圖5 融合蛋白純化的SDS-PAGE分析Fig.5 Purification of fusion protein

圖6 融合蛋白的Western blot分析Fig.6 Western blot of fusion protein

［1］Masschalck B，Michiels C W.Antimicrobial properties of lysozyme in relation to foodborne vegetative bacteria［J］.Crit Rev Microbiol，2003，29:191-214.

［2］Ferre R，Melo M N，Correia A D，et al.Synergistic effects of the membrane actions of cecropin-melittin antimicrobial hybrid peptide BP100［J］.Biophys J，2009，96:1815-1827.

［3］Gregory SM，Cavenaugh A，Journigan V，et al.A quantitative model for the all-or-none permeabilization of phospholipid vesicles by the antimicrobial peptide cecropin A［J］.Biophys J，2008，94:1667-1680.

［4］Arcidiacono S，Soares J W，Meehan A M，et al.Membrane permeability and antimicrobial kinetics of cecropin P1 against Escherichia coli［J］.J Pept Sci，2009，15:398-403.

［5］Chalk R，Townson H，Natori S，et al.Purification of an insect defensin from the mosquito，Aedes aegypti［J］.Insect Biochem Mol Biol，1994，24(4):403-410.

［6］Yoe SM，Kang CS，Han SS，et al.Characterization and cDNA cloning of hinnavin II，a cecropin family antibacterial peptide from the cabbage butterfly，Artogeia rapae［J］.Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol，2006，144(2):199-205.

［7］盧雪梅，金小寶，朱家勇，等.融合基因Mdc-hly的構(gòu)建及原核表達(dá)［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2010(4):150-155.

Optimization of expression conditions and purification of new antibacterial protein Mdc-hly in Escherichia coli

LU Xue-mei1，2，JIN Xiao-bao1，2，ZHU Jia-yong1，2
(1.Institute of Pharmaceutical Bioactive Substances of Guangdong Pharmaceutical University，2.Guangdong Key Laboratory of Pharmaceutical Bioactive Substances，Guangzhou 510006，China)

Purpose To optimize the expression conditions of recombinant Musca domestica cecropinhuman lysozyme(Mdc-hly)and to purify recombinant protein.Methods Recombinant E.coli strains BL21(DE3)with plasmid pET-32a/Mdc-hly were induced at various temperatures，and various cell density with IPTG at different concentrations for different hours.Expressed protein was purified by chromatographic column and identified by Western blot.Results The expression level of fusion protein reached a peak value，accounting for 39.1%of the bacterial total protein，after the recombinant E.coli was induced with 1.0 mmol/L IPTG at 37 ℃，A600=0.6 for 6 h.SDS-PAGE and Western blot analysis indicated that the recombinant protein could be purified to 95%homogeneity.Conclusion The conditions for expression of fusion protein were preliminarily optimized，and the expressed protein was purified.

Musca domestica cecropin;lysozyme;recombinant fusion protein;expression condition;purification

Q786

A

1005-1678(2012)04-0329-04

2012-02-08

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30671832)

盧雪梅，女，碩士，助理研究員，研究方向:藥用生物活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)功能與應(yīng)用研究，Tel:020-39352552，E-mail:luxuemei605@163.com;朱家勇，男，通信作者，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail:zhujy@gdpu.edu.cn。