程新華,向極釬,張 亮,龍 瀾,覃大吉

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)創(chuàng)新中心鄂西綜合試驗站,湖北 恩施 445000;2.恩施清江生物工程有限公司,湖北 恩施 445000)

甜葉菊(SteviarebaudianaBertoni.)為菊科，屬多年生草本植物，其適應(yīng)性強，在我國有廣分布.甜葉菊糖苷又稱甜菊苷、甜菊糖苷、甜菊糖，是從甜葉菊植物中提取，屬于天然無熱量高倍甜味劑.它們是一類具甜味的萜烯類配糖體，為白色粉末.甜葉菊中主要含有甜菊糖苷STV(Stevioside)、RA(Rebaudioside A)、RB(Rebaudioside B)、RC(Rebaudioside C)、RD(Rebaudioside D)和RE(Rebaudioside E)等[1-2].其中，甜菊糖苷STV成分占糖苷總量的60%～70%，其甜度為蔗糖的300倍，其次是RA，約占糖苷總量的15%～20%，其甜度為蔗糖的450倍，其他組分含量都較少[3].甜菊糖在一般加工條件下很穩(wěn)定，具有非發(fā)酵性、非著色性，安全無毒，被廣泛應(yīng)用于食品、釀酒、醫(yī)藥、日用化工等行業(yè)[4].甜菊糖苷的安全性已得到國際FAO和WHO等組織的認可.我國衛(wèi)生部自1985年和1990年分別批準(zhǔn)甜菊糖苷為不限量使用的天然甜味劑和醫(yī)藥用甜味劑輔料，用其制成的食品飲料，長期使用不會使人發(fā)胖，特別適宜肥胖癥、糖尿病、高血壓、動脈硬化、齲齒病患者使用.近年來，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，甜菊糖苷還具有降低血壓，促進胰島素分泌等生物活性.因此，甜菊糖苷是一種安全的天然甜味劑，并廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥行業(yè)中，被譽為繼蔗糖、甜菜糖之后的第三種天然糖源，有著廣泛的應(yīng)用范圍和寬闊的市場前景[5-6].本文采用絮凝、吸附、脫鹽、脫色和重結(jié)晶的方法分離、純化甜菊糖苷.

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

高效液相色譜分析儀(2695分離單元+2696二極管矩陣檢測器，美國waters公司)；BC-R205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海貝凱生物化工設(shè)備有限公司)；Φ24×250 mm玻璃樹脂柱；Φ35×400 mm玻璃樹脂柱；層析系統(tǒng)(UV9091771218紫外檢測器+HEP-200A恒流泵+Φ30×400 mm不銹鋼層析柱+EasyChrom-1 000色譜工作站，北京慧得易科技有限責(zé)任公司)；BT25S十萬分之一電子天平(德國賽多利斯股份有限公司)；DZKW恒溫水浴鍋(北京永光明醫(yī)療儀器廠)；TD5A-WS臺式大容量離心機(金壇市華龍實驗儀器廠)；CHA-SA數(shù)顯氣浴恒溫振蕩器(江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠).

甜菊糖苷STV標(biāo)準(zhǔn)品(美國Sigma公司；甜菊糖苷RA成都科斯曼公司)；AB-8、ADS-7、DM-130、HPD-222、HPD-X、D001、D201大孔型強堿性陰離子交換樹脂(滄州寶恩公司)；乙腈(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；七水硫酸亞鐵(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；氫氧化鈣(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；乙醇(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；甲醇(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；正丁醇(分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠)；鹽酸(分析純，武漢市中天化工有限責(zé)任公司)；氫氧化鈉(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司).

1.2 實驗方法

1.2.1 甜菊糖苷STV和RA的檢測方法 甜菊糖苷STV和RA的檢測方法參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB8270-1999(食品添加劑 甜菊糖甙)和中華人民共和國藥典[7].

1.2.2 甜菊糖苷提取液的制備和除雜 稱取100 g干甜葉菊，按料液比1∶9加入900 mL水于50℃水浴鍋中攪拌提取1.5 h，粗孔過濾，收集濾液，濾渣再按1∶8加入800 mL水于50℃水浴鍋中提取1.5 h，粗孔過濾，收集濾液，濾渣再按1∶8加入800 mL水于50 ℃水浴鍋中提取1.5 h，粗孔過濾，收集濾液，合并三次提取濾液.共得濾液約2 300 mL.將上述濾液平均分成兩份，即每份為1150 mL.其中一份濾液加入5 g FeSO4·7H2O，邊攪拌邊加入CaO調(diào)節(jié)pH至9～9.5，放置2 h進行絮凝后準(zhǔn)備過濾.由于上述兩份濾液中含有大量的雜質(zhì)，用濾紙抽濾的方式過濾較難進行，所以先將濾液用離心機在一定的離心條件下(4 500 r/min，10 min)進行離心后再抽濾，抽濾效果較好，即得未絮凝提取液2 200 mL，絮凝后的提取液2 100 mL.分別測定除雜率和甜菊糖苷的損失率.

1.2.2.1 除雜率的測定 分別準(zhǔn)確量取未絮凝和絮凝后的提取液20 mL，置于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，移入110℃烘箱干燥至恒重后稱重，得干燥浸膏質(zhì)量，按照下式計算除雜率x1：

1.2.2.2 甜菊糖苷的損失率的測定 分別測定絮凝前后提取液的STV或RA的濃度，按照下式計算甜菊糖苷的損失率x2：

1.2.3 不同型號樹脂的選型

1.2.3.1 樹脂的預(yù)處理 大孔吸附樹脂AB-8屬于弱極性、DM-130屬于中等極性、HPD-222屬于中等極性、HPD-X屬于中等極性.樹脂的預(yù)處理：首先取一定量的樹脂于燒杯中，加入純凈水，從上方將樹脂碎片和其他雜質(zhì)倒出，再加入純凈水直至無明顯的混濁，然后將樹脂中的水濾干，轉(zhuǎn)移至另一個干凈的燒杯中，加入95%乙醇，浸泡12 h，每2 h攪拌一次充分除去氣泡.然后在樹脂柱內(nèi)加入適量的95%乙醇，將適量的樹脂轉(zhuǎn)移至樹脂柱內(nèi)，然后用2～4 BV的95%乙醇以2 BV/h的流速通過樹脂層，直至流出液加水后無混濁現(xiàn)象為止.然后用純凈水沖洗樹脂柱，直至流出液無乙醇為止，備用.

ADS-7屬于極性樹脂，樹脂的預(yù)處理：首先取一定量的樹脂于燒杯中，加入純凈水，從上方將樹脂碎片和其他雜質(zhì)倒出，再加入純凈水直至無明顯的混濁，然后將樹脂中的水濾干，轉(zhuǎn)移至另一個干凈的燒杯中，加入95%乙醇，浸泡12 h，每2 h攪拌一次充分除去氣泡.然后在樹脂柱內(nèi)加入適量的95%乙醇，將適量的樹脂轉(zhuǎn)移至樹脂柱內(nèi)，然后用2～4 BV的95%乙醇以2 BV/h的流速通過樹脂層，直至流出液加水后無混濁現(xiàn)象為止.然后用純凈水沖洗樹脂柱，直至流出液無乙醇為止.然后再用2～3 BV的3%～5%的鹽酸溶液以2 BV/h的流速通過樹脂層，用水淋洗至接近中性后用2～4 BV的3%～5%的氫氧化鈉溶液以2 BV/h的流速通過樹脂層，用水淋洗至接近中性，備用.

D001和D201屬于離子交換樹脂，樹脂的預(yù)處理：首先取一定量的樹脂于燒杯中，加入純凈水，從上方將樹脂碎片和其他雜質(zhì)倒出，再加入純凈水直至無明顯的混濁.然后濕法裝柱，用2～3 BV的7%～8%的氯化鈉溶液以2 BV/h的流速通過樹脂層，并且浸泡12 h后用純凈水將樹脂中的氯化鈉淋洗干凈.D001樹脂柱首先用2～3 BV的3～5%的鹽酸溶液以2 BV/h的流速通過樹脂層，并且浸泡8 h，然后用水淋洗至接近中性，再用2～4 BV的3～5%的氫氧化鈉溶液以2 BV/h的流速通過樹脂層，并且浸泡8 h，然后用水淋洗至接近中性；D201樹脂柱首先用2～4 BV的3～5%的氫氧化鈉溶液以2 BV/h的流速通過樹脂層，并且浸泡8 h，然后用水淋洗至接近中性后用2～3 BV的3～5%的鹽酸溶液以2 BV/h的流速通過樹脂層，并且浸泡8 h，然后用水淋洗至接近中性.將D001和D201樹脂柱進行反洗，進一步去除預(yù)處理中釋放出來的低聚物，直至反洗出水澄清為止，待再生.樹脂的初次再生：D001樹脂柱首先用3.5 BV的鹽酸溶液以一定的流速淋洗，淋洗的時間要到達2 h，然后用脫鹽水(去離子水)淋洗至基本呈中性，備用；D201樹脂柱首先用3.5 BV的氫氧化鈉溶液以一定的流速淋洗，淋洗的時間要到達2 h，然后用脫鹽水(去離子水)淋洗至基本呈中性，備用.

1.2.3.2 大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附

1)吸附：分別取上述處理好的AB-8、ADS-7、DM-130、HPD-222、HPD-X大孔吸附樹脂適量，用濾紙吸干樹脂表面的水分，準(zhǔn)確稱取樹脂1 g，轉(zhuǎn)移至50 mL的錐形瓶中.每一種樹脂取兩份，分別加入上述絮凝后的提取液40 mL，將錐形瓶放置恒溫振蕩器中，密封，于120 r/min，25℃振蕩12 h，將吸附后的溶液取樣，待測，按照下式計算樹脂的靜態(tài)吸附量x3：

其中：x3—樹脂靜態(tài)吸附量，mg/g樹脂；C0—吸附前提取液中甜菊糖苷STV和RA的濃度，mg/mL；C1—吸附后溶液中甜菊糖苷STV和RA的濃度，mg/mL；V1—吸附實驗所取的提取液的體積，mL；m1—吸附所取的樹脂的質(zhì)量，g.

2)解吸：將上述的吸附飽和的樹脂過濾，分離樹脂，然后用適量水淋洗樹脂表面吸附的提取液，然后將樹脂全部轉(zhuǎn)移至另外干凈的50 mL的錐形瓶中，加入40 mL的70%乙醇，將錐形瓶放置恒溫振蕩器中，密封，于120 r/min，25℃振蕩8 h，將解吸后的溶液取樣，待測，按照下式計算樹脂的解吸率x4：

其中：x4—樹脂的解析率，%；C0—吸附前提取液中甜菊糖苷STV和RA的濃度，mg/mL；C1—吸附后溶液中甜菊糖苷STV和RA的濃度，mg/mL；V1—吸附實驗所取的提取液的體積，mL；V2—解吸液的體積，mL.

1.2.3.3 大孔吸附樹脂的動態(tài)吸附 將適量的提取液上大孔吸附樹脂柱，上柱速度為2～3 BV/h，檢測流出液中甜菊糖苷STV和RA的濃度，上柱完畢后首先用2 BV的脫鹽水以3 BV/h進行除雜，然后再用一定濃度的乙醇溶液洗脫，洗脫速度為2～3 BV/h，收集洗脫液，濃縮回收乙醇，得甜菊糖苷待脫鹽液.取適量的洗脫液干燥，檢測其中STV和RA的純度.

1.2.3.4 脫鹽、脫色 將D001和D201樹脂串聯(lián)，甜菊糖苷待脫鹽溶液上柱，上柱速度為2～3 BV/h，檢測流出液中甜菊糖苷STV和RA的濃度，上柱完畢后首先用2 BV的脫鹽水以3 BV/h進行除雜，然后用一定濃度的乙醇溶液分別洗脫D001和D201，并且分別收集D001和D201樹脂柱的洗脫液，將D001和D201樹脂柱的洗脫液干燥后檢測STV和RA的純度.

1.2.3.5 重結(jié)晶純化甜菊糖苷STV和RA 采用不同的溶劑，如甲醇、乙醇、正丁醇及其溶液在適當(dāng)?shù)臏囟认氯芙?，然后在室溫以及冰箱中冷藏結(jié)晶，將晶體洗滌后干燥，檢測晶體中的STV和RA純度.

2 結(jié)果與討論

2.1 甜菊糖苷提取液的除雜

稱取干甜葉菊100 g，按上述方法提取后得提取液，然后將提取液平均分為兩份，其中一份未絮凝，另外一份用FeSO4·7H2O絮凝，比較絮凝前后的除雜效果和甜菊糖苷的損失率.甜菊糖苷STV和RA的標(biāo)準(zhǔn)品HPLC檢測圖譜見圖1，絮凝前的STV和RA的HPLC檢測圖譜見圖2，絮凝后的STV和RA的HPLC檢測圖譜見圖3.

圖1 STV和RA標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖 圖2 絮凝前甜葉菊提取液的HPLC色譜圖

圖3 絮凝后甜葉菊提取液的HPLC色譜圖

表1 絮凝前后的除雜效果和甜菊糖苷的損失率

表2 不同大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附量和解吸率

從圖2和圖3可知，絮凝后的圖譜中，STV和RA的峰面積小于絮凝前的峰面積，說明絮凝會降低STV和RA的濃度，會造成STV和RA損失.

絮凝前后的除雜效果和甜菊糖苷的損失率見表1.從表1可知，用硫酸亞鐵絮凝后，甜菊糖苷STV和RA會有一定的損失，是由于在化學(xué)絮凝時，絮凝劑間會發(fā)生化學(xué)反應(yīng)生成膠核，由于膠核帶正電荷使提取液中的帶負電的雜質(zhì)聚沉，而且由于膠體的架橋作用，也會使提取液中的其他的大分子物質(zhì)沉降.當(dāng)膠核過量時，同時吸附甜菊糖苷分子中的羥基上的孤對電子，使甜菊糖苷聚沉，所以在加入絮凝劑量大時，甜菊糖苷的損失會較大.由于絮凝后溶液的澄清度明顯大于未絮凝的溶液，除雜率達到30%以上，除雜效果較好.所以即使絮凝會加大甜菊糖苷的損失，但是由于絮凝可以出去提取液中的一些雜質(zhì)，減輕了后續(xù)吸附和脫鹽、脫色負荷，絮凝工藝是可取的除雜工序.

2.2 大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附

取50 g干甜葉菊，按上述步驟提取和絮凝，制備得絮凝后的提取液.分別稱取1 g預(yù)處理好的AB-8、ADS-7、DM-130、HPD-222、HPD-X樹脂，按靜態(tài)吸附實驗方法進行大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附和解吸.靜態(tài)吸附實驗的吸附量和解吸率見表2.

從表2可以看出，HPD-X大孔吸附樹脂的吸附量和解吸率在上述樹脂中是最高的，適合吸附甜菊糖苷.ADS-7樹脂的脫色效果最好，在吸附的過程中，吸附后的溶液顏色最淺，樹脂顏色最深，與文獻[8]的結(jié)果一致,但是ADS-7樹脂的吸附量和解吸率都不高，不適合吸附甜菊糖苷.DM-130和HPD-222樹脂吸附量都不高，也不適合吸附甜菊糖苷.HPD-X大孔吸附樹脂是一種新型的接枝聚合物，利用聚苯乙烯共聚物中的懸掛雙鍵，將極性基團負載到樹脂骨架上，在增加樹脂表面極性、提高吸附選擇性的同時，避免了傳統(tǒng)極性單體與苯乙烯共聚不均勻造成的塌孔，使樹脂保持了高的比表面積，高吸附容量.

2.3 大孔吸附樹脂的動態(tài)吸附

取500 g干甜葉菊，按上述步驟提取和絮凝，制備得絮凝后的提取液.將提取液平均分為五份.分別稱取100 g預(yù)處理好的AB-8、ADS-7、DM-130、HPD-222、HPD-X樹脂，加入樹脂柱中.將提取液以2～3 BV/h進行上柱，剛開始每50 mL取樣一次，當(dāng)流出液達到1 000 mL時，每20 mL取樣一次，直至出現(xiàn)漏點即流出液含有STV和RA.然后用2 BV的脫鹽水以2～3 BV/h進行除雜，然后用4 BV的70%乙醇以2～3 BV/h進行洗脫，收集洗脫液，將洗脫液回收乙醇后得無醇待脫鹽液.取適量的洗脫液干燥，檢測其中STV和RA的純度.動態(tài)吸附實驗結(jié)果見表3.

表3 不同大孔吸附樹脂的動態(tài)吸附實驗結(jié)果

表4 脫鹽和脫色實驗結(jié)果

從表3可知，HPD-X出現(xiàn)漏點時的流出液的體積為1 820 mL，大于其他類型的大孔吸附樹脂，即HPD-X的動態(tài)吸附量大于其他類型的樹脂，與靜態(tài)吸附實驗結(jié)果一致.從待脫鹽液干燥樣品的純度看，HPD-X樹脂初步除雜后的樣品中的STV和RA的純度達到45.31%和26.40%，均高于其他樹脂，說明HPD-X適合初步純化甜菊糖苷提取液.

2.4 脫鹽、脫色

分別稱取100 g經(jīng)過預(yù)處理并且再生為H-型和OH-型的D001和D201離子交換樹脂，濕法裝柱.將二者串聯(lián)并且待上柱液上柱時先通過陽離子交換樹脂D001再通過陰離子交換樹脂D201進行脫鹽、脫色.將2.3節(jié)中經(jīng)過HPD-X初步純化的無醇待脫鹽液以2～3 BV/h速度進行上柱，收集流出液I.上柱完畢后先用2 BV的脫鹽水以2～3 BV/h速度進行淋洗，收集流出液II，將流出液I和II合并，真空干燥得脫鹽、脫色干燥樣品.然后將D001和D201樹脂柱用70%乙醇分別洗脫，70%乙醇用量各為4 BV，洗脫速度為2～3 BV/h.分別收集D001樹脂柱洗脫液和D201樹脂柱洗脫液，減壓濃縮，干燥得D001樹脂柱洗脫液干燥樣品和D201樹脂柱洗脫液干燥樣品.脫鹽、脫色實驗結(jié)果見表4.

圖4 高純度甜菊糖苷樣品的HPLC色譜圖

從表4可知，用D001和D201串聯(lián)可以對甜菊糖苷溶液進行脫鹽和脫色，通過脫鹽和脫色工序可以提高樣品的純度，STV和RA的純度達到85%以上而且甜菊糖苷樣品的色度也有很大的改善.D001樹脂可以吸附大量的色素，無醇待脫鹽液干燥樣品顏色為黃色，通過脫鹽、脫色工序后樣品的顏色為淡黃色或白色，說明脫色效果達到一定的效果，而且D001樹脂柱用70%乙醇洗脫后的的干燥樣品的質(zhì)量僅為0.14 g，說明D001樹脂對甜菊糖苷STV和RA幾乎不吸附或者吸附量很少.但是，D201樹脂柱用70%乙醇洗脫后的的干燥樣品的質(zhì)量達到0.52 g，說明D201樹脂對甜菊糖苷STV和RA有一定的吸附，需要將D201樹脂柱中吸附的甜菊糖苷洗脫下來.所以在實際的脫鹽、脫色過程中，D001樹脂柱不需要用70%乙醇進行洗脫，直接用酸、堿液再生即可，而D201樹脂柱則需要用一定量的70%乙醇進行洗脫，將流出液和洗脫液合并，減壓回收溶劑，干燥制得甜菊糖苷脫鹽、脫色樣品.

2.5 重結(jié)晶純化甜菊糖苷

取2.4節(jié)制備脫鹽、脫色干燥樣品0.1 g，加入0.4 mL甲醇于50℃水浴中溶解，然后放置0～4℃冷卻結(jié)晶10 h，分離晶體和母液，晶體用1 mL的0～4℃甲醇洗滌兩次，將晶體干燥，得高純度的甜菊糖苷樣品.用HPLC測得高純度的甜菊糖苷樣品中的STV純度達85.04%，RA的純度達13.27%，甜菊糖苷的總純度達98%以上，重結(jié)晶收率達85%以上.高純度甜菊糖苷樣品HPLC檢測圖譜見圖4.

3 結(jié)論

通過上述的實驗可知，首先將甜葉菊用水提取出來，然后經(jīng)過絮凝、吸附、脫鹽、脫色和重結(jié)晶工序可以制備高純度的甜菊糖苷樣品，其STV和RA的總純度可以達到98%以上.甜菊糖苷提取液用硫酸亞鐵鹽進行絮凝，可知除去提取液中的不少雜質(zhì)，減少后續(xù)樹脂的處理負荷；大孔吸附樹脂HPD-X吸附量大，而且解吸率高，適合甜菊糖苷提取液的初步純化，樹脂的吸附量和解吸率能夠滿足工藝需要，而且樹脂通過酸、堿再生可以重復(fù)使用，再生后的樹脂的吸附量接近新的樹脂；將D001和D201樹脂串聯(lián)可以對甜菊糖苷進行脫鹽和脫色，改善甜菊糖苷的品質(zhì)，由于D001樹脂對甜菊糖苷的吸附量小，不需要用乙醇進行洗脫，直接再生即可，而D201樹脂對甜菊糖苷有一定吸附作用，需要用70%乙醇進行洗脫以提高甜菊糖苷的產(chǎn)率，離子交換樹脂通過酸、堿再生可以重復(fù)使用；重結(jié)晶可以進一步提純甜菊糖苷樣品，重結(jié)晶收率達85%以上，STV和RA的總純度達98%以上.該工藝操作簡單，產(chǎn)品能滿足市場需求，適合工業(yè)化生產(chǎn).

[1] 孫傳范,李進偉.甜菊糖苷研究進展[J].食品科學(xué),2010,31(9):38-340.

[2] 馬磊，石巖.甜葉菊的綜合開發(fā)利用[J].中國糖料,2009(1):68-72.

[3] 于聰敏,石巖.甜菊糖甙的測定方法[J].中國糖料,2009(1):65-67.

[4] 李培,楊瑞金,華霄,等.重結(jié)晶法分離甜菊糖的工藝研究[J].食品與機械,2010,26(1):160-163.

[5] 邸多隆,黃新異,陳振斌.從甜葉菊中制備甜菊糖苷的工藝方法[P].中國專利:CN 102060891 A,2011-05-18.

[6] 王貴明，董振紅，郝再彬.甜葉菊糖苷的應(yīng)用和安全性的研究進展[J].中國食品添加劑,2007(6):65-69.

[7] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2000:771-772.

[8] 施榮富，史作清，王春紅，等.吸附樹脂的色層吸附及其在甜菊甙分離純化中的應(yīng)用[J].離子交換與吸附,2001，17(1):23-30.