刁 堯，劉新寧，官文征，趙文瑾，劉 潔，趙 恂，于成國

1.中國醫(yī)科大學(xué) 實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心，遼寧 沈陽 110001；2.阜新市第二人民醫(yī)院，遼寧 阜新 123000；3.中國醫(yī)科大學(xué) 第94期臨床醫(yī)學(xué)七年制英文班，遼寧 沈陽 110001

錳5,10,15,20-(4-苯甲酸)卟啉[ Mn(Ⅲ)tetrakis(4-benzoic acid)porphyrin chloride(MnTBAP)]，分子式 C48H28ClMnN4O8，相對分子質(zhì)量879.2，分子結(jié)構(gòu)式示于圖1。常溫下MnTBAP為黑色晶體。MnTBAP是以卟啉環(huán)為配體的大環(huán)類SOD模擬物和廣譜的游離基清除劑，它同時(shí)具有SOD和過氧化氫酶(catalase,CAT)的特性[1]。文獻(xiàn)報(bào)道MnTBAP具有抗炎、抗氧化、抗自由基損傷、保護(hù)肝臟、神經(jīng)損傷等作用[2-6]。雖然MnTBAP的藥效涉及很多方面，但其在生物體內(nèi)的具體代謝和分布行為的報(bào)道較少，這妨礙了對MnTBAP相關(guān)藥效的更深入研究。本研究擬采用靈敏的放射性示蹤法分析MnTBAP在小鼠體內(nèi)的分布特點(diǎn)，以揭示其主要的代謝方式。

圖1 MnTBAP的分子結(jié)構(gòu)式

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要材料

MnTBAP，Calbiochem公司，純度大于95%；Na131I，中國原子能科學(xué)研究院；Iodogen，Sigma公司；KM小鼠(SYXK(遼)2008-0005)，中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心；FJ-2008PS型γ計(jì)數(shù)儀，西安核儀器廠；PMI 170-9400磷屏成像儀，美國Bio-Rad公司；聚酰胺薄膜，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其它試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 131I-MnTBAP的制備

采用Iodogen法對MnTBAP進(jìn)行131I標(biāo)記。標(biāo)記管中預(yù)先涂以 Iodogen 50 μg，向標(biāo)記管中依次加入50 μL MnTBAP樣品(1 g/L，二甲基亞砜(DMSO)溶解)、10 μL 18.5 MBq Na131I，振蕩反應(yīng)10 min，以生理鹽水溶解，放置備用。以聚酰胺薄膜為支持介質(zhì)，生理鹽水為展開劑，測定其標(biāo)記率和放化純度。

1.3 131I-MnTBAP標(biāo)記化合物放化純度的鑒定

采用薄層層析法，吸取碘化反應(yīng)液2 μL，在距聚酰胺薄膜薄層層析板底端1 cm處點(diǎn)樣，游離131I-作為對照點(diǎn)樣，點(diǎn)樣直徑0.2 cm，冷風(fēng)吹干。生理鹽水為展開劑，上行展開，131I-MnTBAP的Rf=0～0.1，游離的131I-的Rf=0.9。展開結(jié)束后晾干，磷屏成像儀成像，然后分段剪取聚酰胺層析板，經(jīng)γ放免計(jì)數(shù)儀測量放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算標(biāo)記率、放化純度和放射性比活度。標(biāo)記物的標(biāo)記率(%)=(131I-MnTBAP的放射性計(jì)數(shù)/點(diǎn)樣量總放射性計(jì)數(shù))×100；比活度(Bq/μg)=(放射性核素投入量×標(biāo)記率)/投入的MnTBAP總量。

1.4 131I-MnTBAP標(biāo)記化合物的純化

采用薄層層析法，聚酰胺薄膜薄層層析板，6 cm×20 cm，距底邊1.5 cm處鉛筆畫線設(shè)為原點(diǎn)，點(diǎn)樣直徑為0.2 cm，冷風(fēng)吹干。生理鹽水為展開劑，上行展開。晾干，磷屏成像儀成像，根據(jù)已知的Rf值，在原點(diǎn)處刮下聚酰胺粉末(吸附有131I-MnTBAP)置于清潔玻璃小瓶中，DMSO溶解，反復(fù)多次，真空泵吹干標(biāo)記物附著于管壁，DMSO助溶，取2 μL進(jìn)行薄層層析，進(jìn)行放射化學(xué)純度鑒定。

1.5 131I-MnTBAP 標(biāo)記化合物的體外穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取50 μL純化后的標(biāo)記物分別加入到100 μL以下2種體系中：生理鹽水、新鮮人血清。在37 ℃下貯存，分別于2、24、48 h取樣，聚酰胺薄膜層析測定放化純度，觀察標(biāo)記物的穩(wěn)定性。

1.6 131I-MnTBAP的小鼠體內(nèi)分布

42只KM小鼠(約20 g，4周齡)隨機(jī)分為7組(n=6)，各組每只鼠經(jīng)尾靜脈注射200 μL131I-MnTBAP(每只約185 kBq)，各組小鼠分別于注射后5、10、30、60、120、240、1 440 min斷頭處死，取心、肝、脾、肺、腎、肌肉、骨骼、胃、腸、生殖腺、腦、脊髓、甲狀腺、頜下腺、血，稱重，測各個(gè)樣品放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算每克組織放射性攝取占注入量的百分率(%ID/g)。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，結(jié)果采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 131I-MnTBAP的標(biāo)記率及穩(wěn)定性

在以聚酰胺薄膜為支持介質(zhì)、生理鹽水為展開劑的體系中，131I-MnTBAP的Rf=0～0.1，游離的Na131I的Rf=0.9。經(jīng)測定，131I-MnTBAP的標(biāo)記率達(dá)96.3%，放射性濃度為57.45 GBq/L，比活度為0.36 TBq/g。

2.2 131I-MnTBAP的體外穩(wěn)定性

131I-MnTBAP在不同體系中、37 ℃下的穩(wěn)定性結(jié)果示于圖2。由圖2可以看出，標(biāo)記物在人血清和生理鹽水2種體系中，37 ℃下放置48 h，標(biāo)記物的放化純度仍大于90%，表明標(biāo)記物在37 ℃下體外穩(wěn)定性較好。由131I的標(biāo)記位點(diǎn)分析，131I可能標(biāo)記在Mn(Ⅲ)上，即取代Cl或配位于Cl的對位。131I-MnTBAP薄層層析放射性分布圖示于圖3。

圖2 131I-MnTBAP的體外穩(wěn)定性

圖3 131I-MnTBAP薄層層析示意圖

2.3 131I-MnTBAP小鼠體內(nèi)分布

動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表1。表1結(jié)果表明，靜脈注射給藥后131I-MnTBAP在體內(nèi)分布廣泛。血中清除較快，注射后5 min時(shí)即達(dá)峰值，其放射性攝取為5.55%ID/g；肝、腎和肺中分布較高，注射后5 min時(shí)其放射性攝取分別為8.34%ID/g、12.23%ID/g、6.75%ID/g，而后緩慢下降，注射后4 h時(shí)分別為0.34%ID/g、0.73%ID/g、0.13%ID/g，表明131I-MnTBAP在體內(nèi)主要經(jīng)肝、腎代謝；131I-MnTBAP在腦和脊髓中分布較少，注射后5 min時(shí)其放射性攝取均為0.11%ID/g；甲狀腺內(nèi)的放射性隨時(shí)間的延長而逐漸增加，甲狀腺與血液的放射性攝取比值由靜脈注射131I-MnTBAP后5 min時(shí)的1.5倍升至240 min時(shí)的14倍，與時(shí)間基本呈線性關(guān)系。

3 討 論

MnTBAP藥理作用廣泛，主要有抗炎、抗氧化、抗自由基損傷、保護(hù)肝臟、肺臟及腦、脊髓組織氧化損傷等作用[7-9]。它是一種新興的、穩(wěn)定的相對分子質(zhì)量較小的新型非肽類SOD模擬分子，克服了傳統(tǒng)SOD的缺陷，具有以下的優(yōu)點(diǎn)：(1)它同時(shí)具有SOD和過氧化氫酶(catalase,CAT)的特性；(2)相對分子質(zhì)量小，具有細(xì)胞滲透性，易于透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部(如線粒體或微粒體等部位)；(3)不具有免疫原性而不會引起機(jī)體的免疫反應(yīng)；(4)體內(nèi)穩(wěn)定，不發(fā)生分解代謝并可隨著尿液排出,無明顯毒副作用[10-12]。

本實(shí)驗(yàn)制備的131I-MnTBAP標(biāo)記物體外穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，標(biāo)記后48 h的放化純度維持在90%以上(溶于新鮮人血清中)，適于MnTBAP在體內(nèi)外的微量示蹤研究，為下一步研究提供了可靠保障。利用131I-MnTBAP具有靈敏準(zhǔn)確的放射性示蹤特點(diǎn)，可用于觀察分析其在整體生物體內(nèi)的代謝過程和可能的作用靶點(diǎn)。

分布實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，靜脈注射給藥后131I-MnTBAP在體內(nèi)廣泛分布，主要分布于肝、肺、腎，其中，以腎臟分布最多，肝、肺次之，說明肝、肺臟對MnTBAP具有很高的攝取率，腎臟是其主要的代謝臟器，此結(jié)果提示131I-MnTBAP可為MnTBAP保護(hù)肝、肺臟的研究提供一個(gè)靈敏的分析方法。MnTBAP在腦、脊髓中分布較少，揭示其難于透過血腦屏障(BBB)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13]。

表1 131I-MnTBAP在小鼠體內(nèi)的生物分布

注(Note):n=6

131I-MnTBAP在甲狀腺內(nèi)的放射性隨時(shí)間的延長而逐漸增加，反映出其在體內(nèi)有一個(gè)漸進(jìn)性的脫碘過程；同時(shí)體外穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示其在生理鹽水中不夠穩(wěn)定，從分子結(jié)構(gòu)分析，其分子結(jié)構(gòu)存在的苯甲酸基及卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)使得整個(gè)分子極性較大而脂溶性較少，這是分子難于透過BBB的重要原因之一，也是其在生理鹽水中不穩(wěn)定的原因之一，因此，在體內(nèi)生理?xiàng)l件下可能易脫碘而不穩(wěn)定，所以本實(shí)驗(yàn)采用DMSO溶解效果較生理鹽水好。

碘標(biāo)的MnTBAP能靈敏地反映其在小鼠體內(nèi)的基本代謝過程，可進(jìn)一步結(jié)合其它分子生物學(xué)技術(shù)分析其在體內(nèi)精確的代謝行為及可能的作用機(jī)制。

致謝：感謝中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心崔澤實(shí)教授在磷屏成像儀應(yīng)用上給予的支持和幫助。

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