姚小麗，郝 亮，陳秀紅

（1.華北制藥集團(tuán)河北華民藥業(yè)有限公司，河北石家莊 052165；2.石藥集團(tuán)中奇制藥技術(shù)（石家莊）有限公司，河北石家莊 050051）

熊果苷及其中間體的含量測(cè)定

姚小麗1，郝 亮2，陳秀紅1

（1.華北制藥集團(tuán)河北華民藥業(yè)有限公司，河北石家莊 052165；2.石藥集團(tuán)中奇制藥技術(shù)（石家莊）有限公司，河北石家莊 050051）

由于熊果苷對(duì)黑色素合成酶（酪氨酸酶）有很好的抑制效果，對(duì)人體肌膚有良好的美白作用，因而在化妝品中得到廣泛應(yīng)用。由于天然提取法工藝復(fù)雜，生產(chǎn)成本高，不能大規(guī)模生產(chǎn)，人工合成法是熊果苷的主要制備方法。介紹了一種同時(shí)測(cè)定熊果苷及其中間體的檢測(cè)方法，指導(dǎo)和優(yōu)化熊果苷的合成與純化。

熊果苷；高效液相色譜法；葡萄糖；對(duì)苯二酚

熊果苷（arbutin）又名熊果甙、熊果素等，因其最早來源于熊果屬植株的葉子而得名，其物理性狀為白色針狀結(jié)晶或粉末。

熊果苷是一個(gè)集“綠色”、“安全”和“高效”概念于一體的皮膚美白活性物質(zhì)。它能夠迅速滲入肌膚，有效地抑制皮膚中酪氨酸酶的活性，阻斷黑色素的形成，從而減少皮膚色素沉積，祛除色斑和雀斑。該物質(zhì)無毒害性、刺激性、致敏性，同時(shí)還有潤(rùn)膚、愈創(chuàng)、殺菌和協(xié)同抗炎等作用。熊果苷的合成方法主要有天然產(chǎn)物提取法、植物組織培養(yǎng)法、酶轉(zhuǎn)化法和化學(xué)合成法，前3種方法由于產(chǎn)率低或者提取步驟復(fù)雜等原因在目前狀況下不適合工業(yè)化生產(chǎn)?，F(xiàn)在市場(chǎng)上所供應(yīng)的熊果苷大多是通過化學(xué)合成法生成。熊果苷化學(xué)合成的一般步驟是由葡萄糖和氫醌在適當(dāng)保護(hù)后，進(jìn)行糖苷化反應(yīng)，然后脫保護(hù)而得。葡萄糖一般采用全乙酰保護(hù)，氫醌一般是用乙?；Ｗo(hù)其中的一個(gè)羥基［1－2］。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器設(shè)備

UltiMate 3000液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)戴安公司提供），包括：UltiMate 3000 pump（泵）、UltiMate 3000 column compartment（柱溫箱）、UltiMate 3000 photodiode array detector（檢測(cè)器）；RI－101示差檢測(cè)器（日本Shodex公司提供）；AS2060B超聲波清洗器；AB204－S天平（瑞士Mettler Toledo公司提供）。

1.2 試劑

乙腈（色譜純）；五乙酰基葡萄糖（自制），單乙酰對(duì)苯二酚（自制），熊果苷對(duì)照品（純度為98%）；熊果苷樣品（自制）。

1.3 正交試驗(yàn)［2－8］

1.3.1 方案1

流動(dòng)相：甲醇/水/鹽酸，色譜柱：Agilent ZOR－BAX Extend－C18（250 mm×4.6 mm，5μm）。設(shè)計(jì)4因素3水平的正交試驗(yàn)：流速為A；甲醇與水的體積比為B；柱溫為C；鹽酸濃度為D。按照色譜圖的對(duì)稱因子、分離度、理論塔板數(shù)來評(píng)定在各個(gè)條件下的色譜圖，如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)方案1Tab.1 Scheme 1 of orthogonal test

1.3.2 方案2

流動(dòng)相：甲醇/醋酸鹽緩沖液/冰乙酸，色譜柱為Agilent ZORBAX Extend－C18（250 mm×4.6 mm，5μm）。設(shè)計(jì)4因素3水平的正交試驗(yàn)：流速為E；甲醇與醋酸鹽緩沖液的體積比為F；柱溫為G；p H值為H。按照色譜圖的對(duì)稱因子、分離度、理論塔板數(shù)來評(píng)定在各個(gè)條件下的色譜圖，如表2所示。

表2 正交試驗(yàn)方案2Tab.2 Scheme 2 of orthogonal test

1.3.3 方案3

流動(dòng)相：乙腈/水，色譜柱為Shim－pack Vp－ODS（250 mm×4.6 mm，5μm）。設(shè)計(jì)3因素3水平的正交試驗(yàn)：流速為L(zhǎng)；乙腈與水的體積比為M；柱溫為N。按照色譜圖的對(duì)稱因子、分離度、理論塔板數(shù)來評(píng)定在各個(gè)條件下的色譜圖，如表3所示。

表3 正交試驗(yàn)方案3Tab.3 Scheme 3 of orthogonal test

按照正交試驗(yàn)的計(jì)算方法，結(jié)合以上試驗(yàn)數(shù)據(jù)得到如表4所示的結(jié)果。

表4 正交試驗(yàn)分析數(shù)據(jù)Tab.4 Analysis of orthogonal test data

圖1 最佳方案色譜圖Fig.1 Optimum chromatogram

根據(jù)正交試驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)可以知道方案3中的L2M1N2是最佳方案，其中流動(dòng)相比例的調(diào)節(jié)對(duì)分離度影響最大，然后是柱溫箱的溫度和流速。最佳色譜 條 件 為 Shim－pack Vp－ODS（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈/水（體積比為40∶60），流速為1.0 m L/min；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為268 nm。在上述色譜條件下，各物質(zhì)都能很好地分離（見圖1）。

1.4 方法學(xué)考察

1.4.1 線性關(guān)系的考察

取各步反應(yīng)的對(duì)照品適量，精密稱定，用流動(dòng)相溶解，配制成不同濃度的溶液，分別取20μL注入高效液相色譜儀，以峰面積（y）對(duì)進(jìn)樣量的濃度（c）進(jìn)行線性回歸，五乙?；咸烟堑木€性方程為

線性考察范圍為1.022～5.946 mg/m L；單乙酰對(duì)苯二酚的線性方程為

線性考察范圍為0.503～2.495 mg/m L；五乙?；芄盏木€性方程為

線性考察范圍為0.332～2.068 mg/m L；熊果苷的線性方程為

線性考察范圍為0.320～2.318 mg/mL，線性關(guān)系良好。

1.4.2 分析方法的精密度

在同一天的不同時(shí)間進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算精密度，結(jié)果表明熊果苷的RSD值為0.15%（n＝6），五乙酰基葡萄糖RSD值為0.10%（n＝6），單乙酰對(duì)苯二酚RSD值為0.21%（n＝6），五乙酰熊果苷 RSD值為0.45%（n＝6）。結(jié)果表明精密度良好。

1.4.3 樣品及回收率的測(cè)定

如表5所示，制備同一濃度各3份樣品進(jìn)樣，其中熊果苷回收率平均值為98.98%，RSD值為1.60%（n＝3）；第1步產(chǎn)物回收率平均值為99.21%，RSD值為1.48%（n＝3）；第2步產(chǎn)物回收率平均值為97.31% ，RSD值為0.81%（n＝3）；第3步產(chǎn)物回收率為99.68% ，RSD值為0.68%（n＝3）。

結(jié)果表明回收完全，方法可行。

表5 回收率的測(cè)定結(jié)果Tab.5 Determination results of recovery rate

2 結(jié) 語

建立了一種同時(shí)測(cè)定熊果苷及其中間體的方法，通過對(duì)所選方法進(jìn)行的方法學(xué)考察，可以知道此方法能很好地測(cè)定各階段的產(chǎn)物，能為研究各階段的反應(yīng)提供準(zhǔn)確數(shù)據(jù)。

［1］姚 斌，陳萬生，吳秋業(yè).熊果苷合成新工藝［J］.中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2005，22（5）：389－390.

［2］張明光，胡立松，王石發(fā).熊果苷的合成方法及其檢測(cè)研究進(jìn)展［J］.化工時(shí)刊，2006，20（12）：61－64.

［3］黃少嫦，黃百芬，陳青俊，等.應(yīng)用高效液相色譜法測(cè)定化妝品中熊果苷的含量［J］.香料香精化妝品，2001（1）：13－16.

［4］程 鵬，陳梅蘭，朱 松.高效液相色譜法測(cè)定α－熊果苷、β－熊果苷及煙酰胺［J］.色譜，2010，28（1）：89－92.

［5］邱東方，郭應(yīng)臣，王宏偉.反相HPLC法測(cè)定化妝品中熊果苷的含量［J］.化學(xué)研究，2000，11（4）：34－35.

［6］周 峰，盧定強(qiáng).高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定美白類化妝品中熊果苷和氫醌的含量［J］.南通職業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，22（3）：97－99.

［7］王 亮，尚會(huì)建，王麗梅，等.葡糖糖檢測(cè)方法研究進(jìn)展［J］.河北工業(yè)科技，2010，27（2）：132－135.

［8］常虹飛，楊 震.正交試驗(yàn)法優(yōu)選超臨界CO2流體萃取丹參酮工藝的研究［J］.河北工業(yè)科技，2008，25（6）：352－353.

Content determination of arbutin and its intermediate

YAO Xiao－li1，HAO Liang2，CHEN Xiu－h(huán)ong1
（1.Hebei Huamin Pharmaceutical Company Limited，NCPG，Shijiazhuang Hebei 052165，China；2.Zhongqi Pharmaceutical Technology（Shijiazhuang）Company Limited，CSPC，Shijiazhuang Hebei 050051，China）

Arbutin is widely used as cosmetic additive because of its inhibiting effect on human tyrosinase and excellent skin whitening property.Artificial synthesis becomes the dominant means of producing arbutin because of the complicated procedures and the high cost of extracting from natural plant.A determination method of arbutin and its intermediate is introduced to improve technical conditions of synthesis and purification of arbutin.

arbutin；HPLC；glucose；hydroquinone

TQ460.7＋2

A

1008－1534（2012）04－228－04

2012－02－12；

2012－04－23

王海云

姚小麗（1981－），女，河北藁城人，主要從事藥物合成中成品及中間體的檢測(cè)、方法學(xué)驗(yàn)證及藥物穩(wěn)定性考察的研究。