陸云飛 陳曉蓉 劉成

復(fù)方芪術(shù)湯對(duì)四氯化碳致大鼠肝纖維化的影響研究

陸云飛 陳曉蓉 劉成

目的 探討復(fù)方芪術(shù)湯對(duì)四氯化碳(CCl4)致大鼠肝纖維化藥效的干預(yù)作用。方法Wistar雄性大鼠30只，隨機(jī)分為正常組10只和四氯化碳處理組(20只)，四氯化碳1 ml/kg，每周2次腹腔注射，正常組注射等量的生理鹽水。造模的第8周，四氯化碳處理組大鼠隨機(jī)分為復(fù)方芪術(shù)湯組和模型組，每組10只。在繼續(xù)造模的同時(shí)，復(fù)方芪術(shù)湯組給予70千克成人的10倍量灌胃，模型組給予等量的生理鹽水灌胃，給藥4周。12周末處死全部大鼠，留取肝組織樣本和血清，測(cè)定谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、白蛋白(ALB)、總膽紅素(TBiL)。結(jié)果 四氯化碳造模12周，模型組血清ALT、AST活性顯著升高;ALB含量顯著下降。血清TBiL含量顯著升高。與模型組相比，復(fù)方芪術(shù)湯組大鼠血清ALB含量顯著升高，血清ALT和AST活性顯著降低(P＜0.01)。但復(fù)方芪術(shù)湯對(duì)血清TBiL降低不明顯。病理組織學(xué)顯示，模型組假小葉形成，肝臟纖維化程度分級(jí)均為2、3級(jí);復(fù)方芪術(shù)湯干預(yù)組肝小葉結(jié)構(gòu)不同程度被破壞，肝臟纖維化程度分級(jí)大部分在1、2級(jí)。結(jié)論 復(fù)方芪術(shù)湯可以顯著改善大鼠肝功能，對(duì)CCl4引起的慢性肝纖維化大鼠有很好的降低肝纖維化程度的作用。

復(fù)方芪術(shù)湯;四氯化碳;肝纖維化;大鼠

Therapeutic effects of Compound Qizhu Decoction on carbon tetrachloride(CCl4)-induced liver fibrosis in rats LU Yun-fei，CHEN Xiao-rong，LIU Cheng.Department of Traditional Chinese Medicine，Shanghai Public Health Clinical Center，Shanghai 201508，China

肝纖維化是指由各種致病因子所致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，導(dǎo)致肝內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉淀的病理過(guò)程。因該病以“脅部脹痛”、“脅下積塊”等為主要臨床表現(xiàn)，具有中醫(yī)瘀血或積聚痞塊的特征，可歸屬于“積聚”等病的范疇。其主要病因病機(jī)為正虛血瘀，基于此理論，選擇具有“健脾益氣、活血化瘀”治法的復(fù)方芪術(shù)湯為代表，觀察其對(duì)四氯化碳肝纖維化大鼠的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

Wistar雄性大鼠30只，清潔級(jí)，體重(180±20)g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(滬)2007-0006。上海市公共衛(wèi)生臨床中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心恒溫飼養(yǎng)，自由飲食、造模和觀察。

1.2 藥物與試劑

復(fù)方芪術(shù)湯由黃芪30 g、黨參15 g、茯苓15 g、甘草 6 g、赤芍15 g、白芍15 g、丹皮15 g、丹參15 g、紫草15 g組成，所含的生藥均購(gòu)自上海華宇藥業(yè)有限公司，有明確的原產(chǎn)地，經(jīng)生藥學(xué)專家鑒定為正品，按照原方比例和制法由上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥制劑中心一次制備干燥后冷藏。

1.3 肝硬化模型制備

50%的四氯化碳(CCl4)橄欖油溶液1 ml/kg劑量腹腔注射，每周2次，共12周。

1.4 分組與給藥

隨機(jī)取10只大鼠作為正常對(duì)照組，20只大鼠造模，造模8周末，20只模型大鼠隨機(jī)分為模型組和復(fù)方芪術(shù)湯組，每組10只。復(fù)方芪術(shù)湯干預(yù)組于繼續(xù)造模的同時(shí)按成人(70 kg)體重用量的10倍，以10 ml/kg大鼠體重的容量灌胃給藥(每g含生藥6.39 g)，每日1 次，連續(xù)4 周。

1.5 樣品采集和處理

實(shí)驗(yàn)12周末處死全部大鼠，用7%水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰臥位固定，打開(kāi)腹腔，觀察肝脾的色、質(zhì)、形態(tài)等情況。經(jīng)下腔靜脈采血，摘取肝脾，稱重，自肝右葉切取10 cm×0.8 cm×0.3 cm肝組織1塊，10%中性福爾馬林固定，脫水、包埋，進(jìn)行HE染色及天狼星紅染色，觀察肝組織病理變化及肝組織膠原增生程度。血液4℃靜置3小時(shí)后，3000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，分離血清，檢測(cè)肝功能指標(biāo)。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 一般情況 包括大鼠的死亡情況，體重、肝臟大體形態(tài)等。

1.6.2 觀察肝組織病理情況 10倍鏡下隨機(jī)取4個(gè)視野，參照參考文獻(xiàn)方法［1］鏡下檢查肝組織損傷情況，將肝纖維化分為5個(gè)等級(jí):“0”表示無(wú)纖維化;“1”表示匯管區(qū)纖維化擴(kuò)大，限局竇周及小葉內(nèi)纖維化;“2”表示匯管區(qū)周圍纖維化，纖維間隔形成，小葉結(jié)構(gòu)保留;“3”表示纖維間隔伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂，無(wú)肝硬化;“4”表示早期肝硬化。

1.6.3 血清肝功能檢測(cè) 肝功能指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性及白蛋白(ALB)、總膽紅素(TBiL)含量均由上海市公共衛(wèi)生臨床中心檢驗(yàn)科檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

計(jì)量資料以SPSS 18.0中的ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，等級(jí)資料采用Riddit分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠的死亡率、體重等變化

藥物干預(yù)過(guò)程中，模型組大鼠死亡3只，復(fù)方芪術(shù)湯組死亡1只，肝功能衰竭所致。正常組大鼠體重增加平穩(wěn)，模型組大鼠體重增長(zhǎng)相對(duì)緩慢，后期體重有所下降，其中有2只因伴有腹腔積液，體重明顯增加。造模第1周起，模型組大鼠體重即顯著低于正常組。藥物干預(yù)后，復(fù)方芪術(shù)湯組體重略有升高，但與模型組相比無(wú)顯著性差異。

正常大鼠肝臟顏色紅潤(rùn)，質(zhì)地較脆，造模12周結(jié)束時(shí)，模型組大鼠肝臟增大，色澤較黃，表面呈小結(jié)節(jié)狀，結(jié)節(jié)分布均勻，質(zhì)地較硬、韌。復(fù)方芪術(shù)湯組大鼠肝臟色澤紅潤(rùn)，表面較光滑，無(wú)明顯結(jié)節(jié)狀改變，質(zhì)地較柔軟。正常大鼠脾臟紅暗紅，模型大鼠脾臟暗紅顏色加重，充血，增大，巨脾形成。與模型相比，復(fù)方芪術(shù)湯組脾重量及脾指數(shù)顯著降低，充血程度有所減輕。

2.2 大鼠病理組織學(xué)變化

由圖1及表1可見(jiàn)，造模12周后，模型組大部分肝小葉正常結(jié)構(gòu)破壞廣泛，肝細(xì)胞索排列紊亂，肝細(xì)胞腫大，氣球樣變，肝細(xì)胞變性，假小葉形成，肝臟纖維化程度分級(jí)均為2、3級(jí)。復(fù)方芪術(shù)湯干預(yù)組肝小葉結(jié)構(gòu)不同程度被破壞，部分肝細(xì)胞脂肪變性，肝細(xì)胞變性范圍較少，肝細(xì)胞呈小灶狀壞死，局部細(xì)小纖維增生未形成間隔，肝臟纖維化程度分級(jí)大部分在1、2級(jí)。

表1 復(fù)方芪術(shù)湯對(duì)CCl4大鼠肝纖維化的影響

2.3 大鼠肝功能的變化

與正常組相比，造模12周后大鼠血清 ALT、AST活性、TBiL含量顯著升高(P＜0.01)，大鼠血清ALB含量逐漸降低(P＜0.01)。與12周模型組比較，復(fù)方芪術(shù)湯組大鼠血清ALT、AST活性顯著降低(P ＜0.01)，ALB 含量顯著升高(P ＜0.01);復(fù)方芪術(shù)湯對(duì)血清TBiL含量降低有一定降低作用，但不顯著(P ＞0.05)。

3 討論

圖1 各組大鼠肝臟病理形態(tài)(上圖:天狼星紅染色，×10;下圖:HE染色，×20)

表2 復(fù)方芪術(shù)湯對(duì)CCl4大鼠肝功能的影響

肝纖維化是指肝組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)成分過(guò)度增生或異常沉積，導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)或(和)功能異常的病理變化，肝纖維化見(jiàn)于大多數(shù)不同病因的慢性肝臟疾病中，進(jìn)一步發(fā)展，可形成肝硬化，嚴(yán)重影響患者健康與生命。一項(xiàng)前瞻性研究表明，慢性乙型肝炎患者發(fā)展為肝硬化的估計(jì)年發(fā)生率為2.1%，對(duì)HBeAg陰性慢性乙型肝炎進(jìn)行平均9年的隨訪，進(jìn)展為肝硬化和肝癌的發(fā)生率分別為23%和4.4%。代償期肝硬化患者每年發(fā)生肝癌的概率為6%。因此，抗肝纖維化是慢性肝病的重要治療措施。傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)并無(wú)肝纖維化概念，多屬于“癥瘕”“積聚”“脅痛”“臌脹”等范疇。肝纖維化的基本證候病機(jī)為正虛血瘀［1，2］。李東垣在《醫(yī)學(xué)發(fā)明》中指出:“血者，皆肝之所主，惡血必歸于肝，不問(wèn)何經(jīng)之傷，必留脅下?！薄杜R證指南醫(yī)案》也認(rèn)為“初病在氣，久病入血”。因此，中醫(yī)藥防治肝纖維化不僅要活血化瘀，還應(yīng)重視益氣扶正，攻補(bǔ)兼施。多項(xiàng)研究表明，益氣化瘀類中藥對(duì)肝纖維化具有良好的防治作用［3-5］。

上海市公共衛(wèi)生臨床中心在肝硬化診治中，認(rèn)為“虛損致瘀”，臨床以復(fù)方芪術(shù)湯扶助正氣為主，兼以活血化瘀，取得良好療效。該復(fù)方以黃芪補(bǔ)氣健脾為君，臣以黨參、茯苓健脾益氣，佐以赤芍、白芍、丹皮、丹參、紫草活血化瘀通絡(luò)，使以甘草，調(diào)和諸藥，共湊扶正祛邪的作用。

四氯化碳肝硬化模型是一種經(jīng)典的肝硬化模型，模型具有穩(wěn)定、死亡率低等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于肝硬化實(shí)驗(yàn)研究，是一種良好的研究載體。中醫(yī)藥對(duì)CCl4造成的肝損傷及肝纖維化具有較好的防治作用［6，7］。李成浩等［8］研究認(rèn)為黃芪提取物具有明顯的保肝及抗纖維化作用，時(shí)磊等［9］觀察芪術(shù)顆?？赏ㄟ^(guò)下調(diào)實(shí)驗(yàn)大鼠肝臟血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)mRNA的表達(dá)來(lái)抑制肝纖維化的發(fā)生，并通過(guò)調(diào)控Ang-1、Ang-2/Tie-2 mRNA的表達(dá)，阻斷肝竇毛細(xì)血管化的形成而減少肝纖維化的產(chǎn)生［10］。本研究藥效表明:復(fù)方芪術(shù)湯可以顯著改善大鼠肝功能，對(duì)CCl4引起的慢性肝纖維化大鼠有很好的降低肝纖維化程度的作用。從以方測(cè)證，以效測(cè)因的角度也證實(shí)了肝硬化“虛損生積”的理論，故肝硬化的治療應(yīng)該標(biāo)本同治，在活血化瘀的同時(shí)不能忽略顧護(hù)正氣。從現(xiàn)代研究水平來(lái)看，雖然復(fù)方芪術(shù)湯的良好的作用療效，但藥物組成眾多，哪一味中藥在起關(guān)鍵作用，至今不明確，也是本課題組下一步研究的主要方向。

［1］中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)肝病專業(yè)委員會(huì).肝纖維化中西醫(yī)結(jié)合診療指南［J］.中華肝臟病雜志，2006，14(11):866-870.

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［10］劉紹能，時(shí)磊，李敏，等.芪術(shù)顆粒對(duì)肝纖維化模型大鼠Ang-1、Ang-2/Tie-2 的影響［J］.世界華人消化雜志，2009，17(24):2495-2498.

(本文編輯:劉群)

LU Yun-fei，E-mail:luyunfei200@126.com

Objective To investigate the therapeutic effects of Compound Qizhu dedoction on carbon tetrachloride(CCl4)-induced liver fibrosis in rats.Methods 30 Wistar male rats were randomly divided into normal group(10)and CCl4-treated group(20)，CCl4(1 ml/kg)was administratedintraperitoneal to CCl4-treated rats for twice a week for 12 weeks.The normal group injected the same amount of saline.At the first day of the 8 th，the CCl4rats were randomly divided into Compound Qizhu dedoction group(10)and model group(n=10).Both groups continued to receive weekly CCl4treatment for another 4 weeks in addition to daily administration of either saline or Compound Qizhu dedoction，the model group given the same amount of saline.All rats were sacrificed at the 12 weeks.Results Compared with normal rats，alanine aminotransferase(ALT)and aspartate aminotransferase(AST)activity and total bilirubin(TBiL)in the serum was significantly increased in the 12 weeks model rats(P ＜ 0.01)，the albumin(ALB)content decreased remarkably(P ＜ 0.01).Compared with model group，ALB content significantly increased in the Compound Qizhu dedoction rats，and ALT and AST activity was significantly decreased(P ＜0.01)，Compound Qizhu dedoction could decrease TBil content in the serum but there were not significant(P ＞0.05).Compared to 12 weeks CCl4rats，hepatic pathological changes and liver functions were improved significantly in Compound Qizhu dedoction.Conclusions Compound Qizhu decoction exerts significant inhibition on CCl4-induced cirrhosis formation in rats.

Compound Qizhu dedoction;CCl4;Liver fibrosis;Rat

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2012.05.007

財(cái)政部、國(guó)家中醫(yī)藥管理局2009年中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(xiàng)(200907001-1)

201508上海市公共衛(wèi)生臨床中心中醫(yī)科

陸云飛(1978－)，碩士，主治醫(yī)師。研究方向:中醫(yī)藥治療感染性疾病。E-mail:luyunfei200@126.com

2012-02-13)