張曉林 孫曉雷 馬信龍

牽張微應(yīng)變對人退變髓核與纖維環(huán)細(xì)胞增殖的影響*

張曉林 孫曉雷 馬信龍△

目的：探討循環(huán)牽張微應(yīng)變對體外培養(yǎng)的人退變髓核與纖維環(huán)細(xì)胞增殖的影響。方法：人退變椎間盤組織來源于1例29歲腰椎間盤突出癥患者的手術(shù)取材，病理學(xué)診斷評估其退變程度，無菌條件下酶消化法分別原代培養(yǎng)髓核與纖維環(huán)細(xì)胞，并對細(xì)胞系進(jìn)行鑒定。將第3代細(xì)胞接種于硅橡膠膜載體上，利用EF3200力學(xué)試驗(yàn)儀搭載的BioDynamic生物反應(yīng)艙系統(tǒng)，對其施加頻率為0.25 Hz，應(yīng)變?yōu)? με、5萬με、10萬με和15萬με的加載3 h，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測不同微應(yīng)變環(huán)境下2種細(xì)胞的增殖活性。結(jié)果：退變髓核與纖維環(huán)細(xì)胞應(yīng)力加載后生長狀態(tài)良好。隨著微應(yīng)變的增加，髓核細(xì)胞S期細(xì)胞比例在10萬με、15萬με時(shí)均高于纖維環(huán)細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；纖維環(huán)細(xì)胞增殖指數(shù)（PI）在各微應(yīng)變加載組均高于髓核細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：微應(yīng)變刺激對人退變髓核與纖維環(huán)細(xì)胞的增殖總體效應(yīng)是一致的，但相同的微應(yīng)變刺激對纖維環(huán)細(xì)胞增殖的促進(jìn)效應(yīng)明顯高于髓核細(xì)胞。

椎間盤移位 流式細(xì)胞術(shù) 椎間盤退變 髓核細(xì)胞 纖維環(huán)細(xì)胞 牽張微應(yīng)變 增殖指數(shù)

椎間盤退變（intervertebral disc degeneration,IVDD）是臨床上腰痛最常見的病理基礎(chǔ)因素[1-2]，但其退變機(jī)制涉及體內(nèi)多重因素的協(xié)調(diào)與調(diào)節(jié)過程[3]。近年來生物力學(xué)因素在椎間盤退變過程中發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用越來越受到關(guān)注[4-6]。髓核與纖維環(huán)所含基質(zhì)成分的差異導(dǎo)致其力學(xué)特性及力學(xué)生物效應(yīng)均有明顯不同。IVDD的主要病理改變?yōu)樽甸g盤細(xì)胞功能的退變及椎間盤基質(zhì)的成分、結(jié)構(gòu)與功能的改變[7-8]。椎間盤2種不同細(xì)胞在退變中所表現(xiàn)出來的差異及原因，對于研究椎間盤退變的機(jī)制有著重要的提示意義，本研究在體外細(xì)胞水平觀察力學(xué)刺激對退變髓核及纖維環(huán)細(xì)胞的影響，以期為IVDD的預(yù)防與治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（GIBCO，美國），乙二胺乙酸二鈉（EDTA）、Ⅰ型及Ⅱ型膠原、胰蛋白酶（Sigma，美國），甲苯胺藍(lán)溶液（東勝泰博，北京），抗人Ⅱ型膠原多克隆抗體（武漢博士德），ElectroForce 3200力學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器、BioDynamic生物反應(yīng)艙系統(tǒng)（Bose，USA），CO2培養(yǎng)箱（Hera-cell，德國），恒溫?fù)u床（Heidolph，德國），倒置顯微鏡（OLYMPUS，日本），細(xì)胞培養(yǎng)板（corning，美國），流式細(xì)胞儀（BD，美國）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本取材 人退變椎間盤組織為1例29歲男性腰椎間盤突出癥患者手術(shù)標(biāo)本，從標(biāo)本髓核與纖維環(huán)原有界限、裂隙、纖維束變化及細(xì)胞數(shù)量與集群等方面對椎間盤退變情況進(jìn)行分級[9]，取材嚴(yán)格無菌操作。

1.2.2 髓核與纖維環(huán)細(xì)胞原代培養(yǎng) 無菌條件下，清洗剔除脂肪、軟骨組織，分離髓核與纖維環(huán)組織，D-Hanks液沖洗3遍，雙抗浸泡3 min，分別以眼科剪剪碎髓核與纖維環(huán)組織為約1 mm×1 mm×1 mm大小。髓核組織以0.25%的胰蛋白酶和0.2%的Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化，37℃搖床200 r/min，90 min，過鋼網(wǎng)收集消化液，1 000 r/min離心7 min，棄上清液，DMEM/F12培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，按2×105/mL接種于培養(yǎng)瓶中，加入含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；纖維環(huán)組織以0.25%胰酶在37℃下?lián)u床消化30 min，棄上清液。剩余組織加入含有0.25%胰酶、0.25%Ⅰ型膠原酶、0.2%Ⅱ型膠原酶的D-Hanks消化液中，4℃冷消化8 h，次日37℃搖床中消化2 h，鋼網(wǎng)過濾收集消化液，1 000 r/min離心7 min，棄上清液，DMEM/F12培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，以2×105/mL密度接種于培養(yǎng)瓶中，加入10%FBS高糖DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)胞鑒定 （1）形態(tài)學(xué)觀察。倒置相差顯微鏡下觀察P2代髓核與纖維環(huán)細(xì)胞形態(tài)。（2）甲苯胺藍(lán)染色。P1代髓核與纖維環(huán)細(xì)胞分別爬片，至80%融合時(shí)，4%多聚甲醛固定15 min，1%甲苯胺藍(lán)染色10 min，PBS沖洗，二甲苯透明，中性樹脂封片，鏡下觀察細(xì)胞分泌糖胺聚糖能力。（3）Ⅱ型膠原免疫組化染色。P1代髓核與纖維環(huán)細(xì)胞分別爬片，至80%融合時(shí)，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%triton X-100打孔20 min，PBS清洗3次；3%H2O2作用15 min，PBS沖洗3次；滴加10%山羊血清封閉液室溫封閉10 min，甩掉后充分晾干；滴加1∶50稀釋的Ⅱ型膠原多克隆抗體，4℃孵育過夜，PBS沖洗3次；滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗工作液，室溫孵育2 h，DAB避光顯色15 min；設(shè)陰性對照組，沖洗、脫水、封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 對細(xì)胞行單軸向循環(huán)牽張應(yīng)力加載 （1）加載周期性牽張力。分別將P3代髓核與纖維環(huán)細(xì)胞以2×105/mL密度接種于4 cm×2 cm硅橡膠膜上，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到約80%，置于BioDynamic力學(xué)生物反應(yīng)艙中進(jìn)行應(yīng)力加載。實(shí)驗(yàn)組每組3個(gè)樣本，分別以0 με、5萬με、10萬με和15萬με加載，頻率為0.25 Hz加載3 h。實(shí)驗(yàn)所用BioDynamic生物反應(yīng)艙力學(xué)加載裝置以硅橡膠膜片作為細(xì)胞微應(yīng)變加載載體，微應(yīng)變加載系統(tǒng)由Bose PCI和Win Testing聯(lián)合控制參數(shù)、持續(xù)時(shí)間、拉伸、松弛頻率，使彈性膜片產(chǎn)生精準(zhǔn)應(yīng)變，使培養(yǎng)在其膜表面的細(xì)胞受到張應(yīng)力作用。微應(yīng)變大小以硅橡膠膜載體拉伸應(yīng)變率（%）表示，應(yīng)變率越大，表示細(xì)胞所受張應(yīng)力越大。（2）流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期。細(xì)胞加載結(jié)束后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，酶消化法分別收集各組髓核與纖維環(huán)細(xì)胞，1 000 r/min離心7 min棄上清，用無菌D-Hanks液輕微漂洗2次，75%乙醇固定，0.1%triton X-100處理30 min，10 mg/L碘化丙啶染色，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞DNA含量和細(xì)胞周期，F(xiàn)low Plus軟件處理數(shù)據(jù)。根據(jù)細(xì)胞周期中G0/G1期和G2/M期細(xì)胞比例計(jì)算S期細(xì)胞比例（%）及細(xì)胞增殖指數(shù)（prolifera?tive index，PI）。S期（%）=1-[G0/G1期（%）+G2/M期（%）]，PI（%）=S期（%）+G2/M期（%）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件包處理，符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 椎間盤組織病理 鏡下可見纖維環(huán)組織細(xì)胞成分較少，集群生長，出現(xiàn)血管組織；基質(zhì)纖維束疏松、紊亂，見圖1。結(jié)合病例臨床及病理資料，患者椎間盤為嚴(yán)重退變。

Figure 1 Pathological image of annular fibrosus and nucleus pulposus tissue biopsy（HE×100）圖1 纖維環(huán)與髓核組織病理切片（HE×100）

2.2 人退變纖維環(huán)細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察 原代髓核細(xì)胞24 h后開始有少量細(xì)胞貼壁，5 d后可達(dá)80%融合，多為橢圓、多角形，呈類軟骨樣，胞核大而圓，胞漿豐富，內(nèi)含分泌顆粒，見圖2，隨著傳代髓核細(xì)胞貼壁時(shí)間變短，其增殖速度加快。纖維環(huán)細(xì)胞原代接種后24 h可見大部分細(xì)胞貼壁，主要為梭形，呈成纖維樣魚群生長，可見增殖旺盛的生發(fā)中心，4 d可達(dá)到95%以上融合，見圖3。

Figure 2 Nucleus pulposus cells cultured for 5 d（×100）圖2 髓核細(xì)胞原代培養(yǎng)5 d（×100）

Figure 3 Annulus fibrosus cells in primary culture for 4 d（×100）圖3 纖維環(huán)細(xì)胞原代培養(yǎng)4 d（×100）

2.2.2 甲苯胺藍(lán)染色 髓核細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色顯示胞質(zhì)均勻藍(lán)染，胞核染色強(qiáng)于胞質(zhì)，細(xì)胞分泌糖胺多糖的功能活躍，見圖4；纖維環(huán)細(xì)胞核呈藍(lán)色，基質(zhì)著色沒有髓核強(qiáng)，髓核細(xì)胞更接近于類軟骨細(xì)胞特性，見圖5。

Figure 4 Nucleus pulposus cells stained with toluidine blue（×100）圖4 髓核細(xì)胞原代甲苯胺藍(lán)染色（×100）

Figure 5 Annulus cells stained with toluidine blue（×100）圖5 纖維環(huán)細(xì)胞原代甲苯胺藍(lán)染色（×100）

2.2.3 Ⅱ型膠原免疫組化鑒定 細(xì)胞胞質(zhì)呈褐色，髓核細(xì)胞Ⅱ型膠原陽性明顯高于纖維環(huán)細(xì)胞，見圖6、7。

2.2.4 不同牽張微應(yīng)變環(huán)境對人退變髓核、纖維環(huán)細(xì)胞增殖的影響 隨著微應(yīng)變的增加，髓核細(xì)胞S期細(xì)胞比例在10萬με、15萬με時(shí)均高于纖維環(huán)細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表1。纖維環(huán)細(xì)胞PI值在各組微應(yīng)變環(huán)境下均高于髓核細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），見表2。

Figure 6 Nucleus pulposus cells type II collagen immunohistochemical staining（×100）圖6 髓核細(xì)胞Ⅱ型膠原免疫組化（×100）

Figure 7 Annulus fibrosus cells of type II collagen immunohistochemical staining（×100）圖7 纖維環(huán)細(xì)胞Ⅱ型膠原免疫組化（×100）

Table 1 Effect of cyclic stretch strain on the percentage of cells in S phase of human degenerative nucleus pulposus and annulus fibrosus cells表1 不同循環(huán)牽張微應(yīng)變對人退變髓核與纖維環(huán)S期細(xì)胞的影響 （n=6,%）

Table 1 Effect of cyclic stretch strain on the percentage of cells in S phase of human degenerative nucleus pulposus and annulus fibrosus cells表1 不同循環(huán)牽張微應(yīng)變對人退變髓核與纖維環(huán)S期細(xì)胞的影響 （n=6,%）

**P<0.01

組別退變髓核細(xì)胞退變纖維環(huán)細(xì)胞t 0 με 1.90±0.35 1.94±0.37 0.167 5萬με 1.96±0.75 2.33±0.35 1.100 10萬με 7.90±1.33 2.55±0.46 9.339**15萬με 7.94±0.97 2.29±0.71 11.475**

Table 2 Effect of cyclic stretch strain on PI value of human degenerative nucleus pulposus and annulus fibrosus cells表2 不同循環(huán)牽張微應(yīng)變對人退變髓核與纖維環(huán)細(xì)胞PI值的影響 （n=6,%）

Table 2 Effect of cyclic stretch strain on PI value of human degenerative nucleus pulposus and annulus fibrosus cells表2 不同循環(huán)牽張微應(yīng)變對人退變髓核與纖維環(huán)細(xì)胞PI值的影響 （n=6,%）

*P<0.05，**P<0.01

組別退變髓核細(xì)胞退變纖維環(huán)細(xì)胞t 0 με 2.90±1.10 16.94±3.44 9.511**5萬με 6.90±1.49 21.13±3.16 9.966**10萬με 14.10±3.03 24.55±3.70 5.341**15萬με 15.04±4.20 22.19±4.46 2.854*

3 討論

椎間盤由髓核、纖維環(huán)、軟骨終板3部分組成。在組織學(xué)上，椎間盤由細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)形成，細(xì)胞為髓核細(xì)胞與纖維環(huán)細(xì)胞；細(xì)胞外基質(zhì)主要成分為水、膠原和蛋白聚糖。這使得椎間盤具有復(fù)雜的生物力學(xué)性能，使其能夠最大程度地適應(yīng)其特殊的力學(xué)環(huán)境，進(jìn)而影響著其結(jié)構(gòu)與形態(tài)[10-12]。椎間盤退變的主要病理改變?yōu)榧?xì)胞數(shù)量減少及細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)、類型及質(zhì)量的變化。目前認(rèn)為椎間盤退變過程是一種由生物力學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)相互作用引起的復(fù)雜病理過程[13]。包含基質(zhì)的退變和細(xì)胞的退變，但其退變過程最初起于細(xì)胞功能退變還是基質(zhì)功能退變，當(dāng)前研究存在不同認(rèn)識[14]。

本研究取材首先區(qū)分纖維環(huán)及髓核組織，并分別送病理以保證組織來源的可靠性。髓核組織分離出的細(xì)胞主要為軟骨樣細(xì)胞形態(tài)，糖胺多糖、蛋白多糖及Ⅱ型膠原染色均為陽性,符合髓核細(xì)胞的表達(dá)特點(diǎn)。纖維環(huán)組織分離獲取的細(xì)胞多為纖維樣，部分混雜有軟骨樣細(xì)胞但數(shù)量較少，甲苯胺藍(lán)及Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色均陽性表達(dá)。髓核細(xì)胞與纖維環(huán)細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)學(xué)及功能蛋白表達(dá)上并無明顯差異，可能與其組織胚胎學(xué)來源相同有關(guān)。本研究提示髓核與纖維環(huán)細(xì)胞均可歸為纖維軟骨細(xì)胞，這與椎間盤本身的纖維軟骨性質(zhì)是一致的。隨著微應(yīng)變的增加，髓核細(xì)胞S期細(xì)胞百分比在10萬με、15萬με時(shí)明顯高于纖維環(huán)S期細(xì)胞，而纖維環(huán)S期細(xì)胞則始終處于平穩(wěn)狀態(tài)。S期細(xì)胞比例的增加，反映出細(xì)胞處于旺盛的有絲分裂狀態(tài)，可能原因是相同的微應(yīng)變刺激下，髓核細(xì)胞對刺激更敏感，較小的應(yīng)變刺激并未影響纖維環(huán)細(xì)胞的增殖，提示在椎間盤退變過程中髓核細(xì)胞可能對應(yīng)力刺激首先做出反應(yīng)，這與已有研究的髓核退變早于纖維環(huán)退變的結(jié)果是一致的[15]。對于細(xì)胞周期PI值的觀察中，纖維環(huán)細(xì)胞PI值在各個(gè)微應(yīng)變環(huán)境中均高于髓核細(xì)胞PI值，提示在椎間盤退變中，雖然髓核細(xì)胞對應(yīng)力刺激較纖維環(huán)細(xì)胞敏感，但是對較低的微應(yīng)變刺激產(chǎn)生的效應(yīng)，纖維環(huán)細(xì)胞是始終大于髓核細(xì)胞。因此，髓核細(xì)胞的退變雖然早于纖維環(huán)細(xì)胞，但是整個(gè)退變過程中纖維環(huán)細(xì)胞退變速度及程度均大于髓核細(xì)胞。另外，應(yīng)力刺激對于纖維環(huán)細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用具有雙向性，微應(yīng)變對纖維環(huán)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用有著最適宜應(yīng)變值，而對于髓核細(xì)胞并未出現(xiàn)此最適宜微應(yīng)變刺激，可能與研究本身設(shè)計(jì)的微應(yīng)變加載區(qū)間有關(guān)。

生物力學(xué)因素在椎間盤退變過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，本研究觀察到不同微應(yīng)變環(huán)境對體外培養(yǎng)的髓核與纖維環(huán)細(xì)胞產(chǎn)生了不同的增殖效應(yīng)，提示這2種細(xì)胞在退變過程中有著不同的退變機(jī)制并影響整個(gè)椎間盤退變的進(jìn)展，但微應(yīng)變環(huán)境與其他體內(nèi)生理生化因素對椎間盤退變的調(diào)節(jié)機(jī)制仍需深入的研究。

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Effect of Stretch Micro-Strain on Proliferation of Human Degenerated Nucleus Pulposus and Annulus Fibrosus Cells

ZHANG Xiaolin,SUN Xiaolei,MA Xinlong

Department of Spine,Tianjin Hospital,Tianjin 300211,China

Objective:To explore the effect of cyclic stretch micro-strain on the proliferation of cultured human degen?erated nucleus pulposus and annulus fibrosus cells.Methods:The human degenerated intervertebral disc came from a case of 29-year-old patient with lumbar disc herniation,and the degree of degeneration was assessed through the pathological di?agnosis.Under the sterile condition，nucleus pulposus and annulus fibrosus cells were cultured respectively using enzymatic digestion.Cell lines were identified.The third generation cells were seeded on the silicone rubber membrane carrier,using the EF3200 mechanical tester equipped with BioDynamic bioreactor system,imposed a frequency of 0.25 Hz,strain 0 με,50 000 με,100 000 με and 150 000 με loaded 3 h,and then the proliferation activity was detected in different strain environ?ment using flow cytometry.Results:The degenerated nucleus pulposus and annulus fibrosus cells grew well after the stress load.With the micro-strain increased,the percentage of degenerative nucleus pulposus cells in S phase was significantly high?er than that of annulus fibrosus cells in 100 000 με and 150 000 με (P<0.01).The PI value of degenerative annulus fibrosus cells was significantly higher than that of nucleus pulposus cells in every micro-strain value(P<0.05).Conclusion:The overall effect of micro-strain loading on human degenerated nucleus pulposus and annulus fibrosus cells is consistent.The promotion effect on proliferation is significantly higher in annulus fibrosus cells than that of nucleus pulposus cells under the same micro-strain stimulation.

intervertebral disk displacement flow cytometry intervertebral discs degeneration nucleus pulposus cells annulus fibrosus cells stretch micro-strain proliferation index

10.3969/j.issn.0253-9896.2012.08.008

*天津市衛(wèi)生局科技基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號：2011KZ57）

300211天津市天津醫(yī)院脊柱外科（張曉林），骨科研究所（孫曉雷），骨科（馬信龍）

△通訊作者E-mail:maxinlong8686@sina.com

（2012-03-06收稿 2012-07-06修回）

（本文編輯 李國琪）