林 謙 金 玉 周進蘇 陸 芬 李曉樂 李 玫 段招軍

輪狀病毒(HRV)、人杯狀病毒(HuCV)、星狀病毒(AstV)和腸道腺病毒(AdV)是嬰幼兒病毒性腹瀉的主要病原[1]。在中國開展的多項系統監(jiān)測顯示，HRV感染占中國住院腹瀉患兒的26%，社區(qū)腹瀉患兒的10%，是住院腹瀉患兒的首要病原[2]。HuCV包括諾如病毒(NV) 和札如病毒(SV)，NV在人群中普遍易感，常引起腹瀉病的暴發(fā)流行，美國和日本都暴發(fā)過大規(guī)模的NV胃腸炎[3～6]；SV主要引起5歲以下兒童的散發(fā)感染。中國自1995 年方肇寅等[7]在嬰幼兒腹瀉糞便標本中首次檢測出HuCV之后，北京、廣州和蘭州等地區(qū)也陸續(xù)檢出HuCV，感染率僅次于HRV[8～11]。AstV亦是引起嬰幼兒急性腹瀉的主要病原[12,13]，中國還沒有暴發(fā)流行的相關報道，但在北京、天津和鄭州等地區(qū)有少量散發(fā)感染的報道[14～16]。1995年，程緒杰等[17]首次從中國腹瀉患兒糞便中檢測到AdV；2004年，曹衛(wèi)中等[18]報道某幼兒園由AdV感染引起的暴發(fā)性腹瀉。目前中國對AdV的研究相對較少。近年，蘭州、廣州、河北、南京和長春等地相繼報道上述4種病毒在嬰幼兒腹瀉中的感染情況[19～23]。本研究收集2009年7月至2010年6月南京醫(yī)科大學附屬南京兒童醫(yī)院(我院)5歲以下腹瀉患兒的糞便標本，對以上4種病毒進行檢測，以了解上述4種病毒在我院的流行特征，為病毒性腹瀉的防治提供基礎數據和理論依據。

1 方法

1.1 標本納入標準 指派專門人員固定于每周三、五上午8：00～12：00對我院消化科門診就診的患兒進行登記，并留取初次就診、病程≤3 d、每日大便次數增加≥3次、大便性狀發(fā)生改變(包括稀水樣、蛋花湯樣或稀糊樣)、糞便鏡檢WBC≤5·HP-1的5歲以下腹瀉患兒的糞便標本。

1.2 標本排除標準 在納入標本中排除黏液便、膿血便，確診為其他疾病(如肺炎、幼兒急疹等)患兒的糞便標本。

1.3 標本收集 標本采集后立即于-20℃保存，3 d內移至-80℃冰箱保存，每3個月由專人用冰盒外充液氮送至北京中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所腸道病毒室進行統一檢測。

1.4 月齡分組 因病毒性腹瀉以2歲以下兒童為主要感染人群，為更好地觀察該人群的發(fā)病率，大多數文獻均將24月齡以內的患兒以每6個月為一組作為觀察對象[19,21]，2歲以上的患兒因感染人數較少,故各文獻分組標準各異。本研究以每6個月為一年齡觀察組，30月齡后以48月齡為界分為兩組。根據上述標準，本研究將病毒性腹瀉患兒分為<6月齡，～12月齡，～18月齡，～24月齡，～30月齡，～48月齡和～59月齡組。

1.5 主要材料和試劑 Taq DNA聚合酶、AMV逆轉錄酶和隨機引物購自美國Promega公司，SuperscriptⅡ或Ⅲ反轉錄酶(5×first strand buffer ，0.1 mmol·L-1DTT)購自美國Invitrigen公司，RNA酶抑制劑(RNasin)、DNA Maker DL 100和2 000購自寶生物工程(大連)有限公司，病毒核酸提取試劑盒購自Geneaid公司，dNTPs(dGTP/dATP/dCTP/dTTP)購自sbs賽百盛公司， HRV ELISA試劑盒(IDEIATM Rotavirus試劑盒)購自丹麥Dako Cytomation公司；QIAGEN Quick Gel Extraction購自德國Promega公司。

1.6 病毒檢測 A組HRV檢測采用ELISA試劑盒，應用Trizol提取HRV RNA，逆轉錄合成病毒cDNA，采用巢式逆轉錄聚合酶聯反應(Nested RT-PCR)方法對HRV陽性標本進行G血清型和P基因型分型。逆轉錄試劑盒及PCR試劑盒均按說明書操作。采用RT-PCR法檢測NV、SV和AstV，采用PCR法檢測AdV。引物見表1，電泳圖見圖1。

表1 用于HRV、HuCV、AstV和AdV的寡聚核苷酸引物

Notes 1)HRV: G/P typing; HuCV, AstV and AdeV: polarity

2 結果

2.1 一般情況 2009年7月至2010年6月我院消化科就診的考慮病毒性腹瀉的患兒2 958例。本研究共收集符合納入和排除標準的糞便標本300份，其中男188例，女112例。年齡1～59月齡，平均(10.5±9.2)月齡。

2.2 HRV檢測、分型及流行病學特點 HRV陽性113/300份，陽性率37.7%。對113份HRV陽性標本進行G血清型和P基因型鑒定。G血清型結果：G1型2份(1.8%)，G2型10份(8.8%)，G3型44份(38.9%)，G9型1份(0.9%)，G2+G3型2份(1.8%)，未能分型54份(47.8%)，未發(fā)現G4和G8型；P基因型結果：P[4]型19份(16.8%)，P[8]型38份(33.6%)，未能分型56份(49.6%)，未發(fā)現P[6]、P[9]和P[10]型。在G血清型和P基因型組合方面，以G3P[8]為主(15.9%，18/113)，其次是G3P[4](9.7%，11/113)和G2P[8](3.5%，4/113)，G2P[4]、G1P[8]和G2+G3P[8]各1份(表2)。

表2 2009至2010年HRV G血清型與P基因型組合(n)

Tab 2 Distribution of rotaviruses G-cerotypes and P-genotypes from 2009 to 2010(n)

TypesNontypedP[4]P[8]TotalNontyped3371454G11012G251410G315111844G2+G31012G91001Total561938113

HRV陽性患兒年齡分布在1～48月齡，平均(10.5±9.2)月齡?！?2月齡組HRV陽性率最高，為43.4%(49/113),與其他月齡組相比差異有統計學意義(χ2=31.793，P=0.000)；其次是<6月齡組(28.3%，32/113)、～18月齡組(17.7%，20/113)和～24月齡組(8.0%，9/113)；～48月齡組HRV陽性率最低(0.9%，1/113) (表3)。HRV感染高峰季節(jié)為2009年10月至2010年1月，占60.2%(68/113)，與其他月份相比差異有統計學意義(χ2=28.599，P=0.000) (圖2)。

2.3 HuCV檢測、分型及流行病學特點 HuCV陽性71/300份(23.7%)，其中NV 67份(22.3%)，SV 4份(1.3%)。

HuCV感染全年均可發(fā)生，于2009年8月出現一個小高峰(圖3)，但與其他月份相比差異無統計學意義(χ2= 0.088，P=0.883)。HuCV陽性患兒年齡分布在2～26月齡，平均(11.0±5.2)月齡，各月齡組間差異無統計學意義(χ2= 18.712，P=0.284)。發(fā)病高峰為～12月齡組，與其他月齡組相比差異有統計學意義(χ2=6.722，P=0.01)(表3)；24月齡以下的患兒占總發(fā)病人數的95.8%(68/71)。

表3 2009年7月至2010年6月HRV、HuCV、AstV和AdV感染的月齡分布[n(%)]

Notes m: months; 1) Compared with other groups,P<0.05

圖2 2009至2010年HRV腹瀉患兒的季節(jié)分布

Fig 2 Seasonal distribution of HRV diarrhea from 2009 to 2010

圖3 2009至2010年HuCV腹瀉患兒的季節(jié)分布

Fig 3 Seasonal distribution of HuCV diarrhea from 2009 to 2010

2.4 AstV檢測、分型及流行病學特點 AstV陽性12/300份(4.0%)，10例發(fā)生于2009年10月至2010年1月,2例分別發(fā)生于2010年3月和5月,季節(jié)分布差異無統計學意義(χ2=5.017，P=0.756)。12例AstV陽性患兒的月齡分布為2～16月齡，平均(8.4±4.9)月齡，各月齡組間的檢出率差異無統計學意義(χ2= 0.513，P=0.47)(表3)。

2.5 AdV檢測、分型及流行病學特點 AdV陽性8/300份(2.7%)，AdV陽性標本PCR產物經克隆測序，AD 2、3、5、7、12和41型各1例，AD 31型2例。2010年1～6月檢出7/8例，2009年7～12月檢出1/8例。發(fā)病月齡高峰集中于～12月齡組(4/8)(表3)。

2.6 4種病毒的混合感染情況 60.0%(180/300)至少檢出4種病毒中的一種。混合感染23份，其中12份(52.2%)為HRV+HuCV，5份(21.7%)為HRV+AstV，2份為HuCV+AstV， HRV+AdV、HuCV+AdV、AdV+AstV、HRV+AstV+HuCV各1份。混合感染男女比例為1.1∶1，年齡2～20(8.3±4.7)月齡。47.8%(11/23)混合感染發(fā)生于2009年10～12月。

3 討論

本課題得到了南京市醫(yī)學科技發(fā)展資金和江蘇省衛(wèi)生廳醫(yī)學科技發(fā)展基金的資助，但因我院僅檢測HRV，其他病毒的糞便標本均送至北京中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所腸道病毒室進行統一檢測。

南京地區(qū)2009年7月至2010年年6月HRV血清型以G3型為主，其次為G2和G1型，G9型僅檢測出1例，未發(fā)現G4和G8型。P基因型為P[8]和P[4]型，未發(fā)現其他分型。G血清型和P基因型組合以G3P[8]為主，其次為G3P[4]，與同一時期蘭州地區(qū)的監(jiān)測結果相同[22]，顯示南京地區(qū)HRV G血清型和P基因型組合毒株呈現多樣性,符合HRV抗原變異導致其流行血清型不斷變化的特點。研究期間南京地區(qū)HRV腹瀉高發(fā)季節(jié)為2009年10月至2010年1月，以秋冬季為主，與同一時期蘭州地區(qū)的監(jiān)測結果相同[19]；2歲以內嬰幼兒HRV感染率達97.3%，提示HRV疫苗的適用對象應為<2歲的兒童。

本研究結果顯示HuCV在南京嬰幼兒腹瀉中普遍存在，僅次于HRV，與廣州地區(qū)[20](23.9%)和河北地區(qū)[21](22.7%)的檢出率相仿，高于2008年南京地區(qū)[22]的檢出率(9.7%)和與本研究同一時期蘭州地區(qū)[19]的檢出率(11.4%)，說明HuCV在南京地區(qū)的感染率呈上升趨勢，且存在各地區(qū)感染的差異性。南京HuCV腹瀉高發(fā)季節(jié)為2009年10～12月，與長春市[23]發(fā)病高峰為11月至次年1月基本一致，與蘭州地區(qū)發(fā)病高峰為12月至次年3月有一定差異[19]。HuCV陽性24月齡以下患兒占95.8%，與長春市[23]報道相符(96.0%)。HuCV感染后潛伏期多為15～50 h，發(fā)病急，病程較短(12～60 h)，呈自限性，預后良好[24]。

隨著分子生物學檢測技術的提高，AstV感染逐漸受到關注。本研究中AstV在南京地區(qū)檢出率為4.0%，與本地區(qū)2006至2007年的檢出率(5.5%)無明顯差異[25]。12例AstV感染患兒中83.3%發(fā)生于2009年10月至2010年1月，以寒冷季節(jié)為主，與HRV流行季節(jié)相似，全部病例均為18月齡以下嬰幼兒。12份AstV陽性標本中有8份與其他病毒混合感染，說明AstV可能極易與其他病毒發(fā)生混合感染。

本研究2009至2010年南京地區(qū)AdV感染率僅為2.7%，與本地區(qū)2006至2007年的檢出率(3.3%)無明顯差異[25]，但低于同一時期蘭州地區(qū)的檢出率(10.7%)[19]。其中Ad 40和Ad 41型屬于F亞組，稱為腸道腺病毒(EAdv)，本次僅檢出1例Ad 41型(1/4，25.0%)，與同一時期蘭州地區(qū)的檢測結果有顯著差異(29/31，93.5%)[19]，說明EAdv在南京感染率較低。

本研究結果顯示，HRV、HuCV、AstV及AdV是南京地區(qū)嬰幼兒病毒性腹瀉的重要病原，占病毒性腹瀉的60%，其中HRV仍是首要病原，HuCV占第2位。不同病原的混合感染率為7.7%，以HRV與其他病毒混合感染為主。病毒性腹瀉的高發(fā)年齡為2歲以下嬰幼兒。本研究仍有40%的標本未檢測出病毒病原，提示可能還存在其他病毒病原，今后的工作中還應加強新病原檢測。

本研究的不足之處和局限性：①本次研究時間僅1年，因經費及人力問題收集標本較少，樣本的代表性尚有限；②有120份陰性標本未能檢測其他病毒，且未能對無癥狀的嬰幼兒進行病毒檢測，進一步了解4種腸道病毒在正常嬰幼兒中的感染狀況，有待在今后的研究中進一步完善。

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