王婷婷 朱汝南 錢 淵 孫 宇 王 芳 鄧 潔 曲 東 李 穎 任曉旭 沙 莉袁 藝 王 菲 李 杰 張寶元

2009年4月，一種新型H1N1流感病毒引起的流感在墨西哥暴發(fā)，之后迅速在全球多個(gè)國(guó)家引起廣泛流行，直至2010年春天。首都兒科研究所病毒研究室是國(guó)家和北京市流感監(jiān)測(cè)的網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室之一，接受首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院送檢標(biāo)本進(jìn)行甲型H1N1流感病毒的篩查。2009年6月至2010年2月，共接收急性呼吸道感染患兒咽拭子標(biāo)本4363份。在統(tǒng)計(jì)分析中發(fā)現(xiàn)，這些標(biāo)本中有近70%為流感病毒陰性，推測(cè)其中有很大一部分為常見(jiàn)呼吸道病毒感染。Lovato-Salas等［1］通過(guò)對(duì)2009年4月至2010年3月下呼吸道感染相關(guān)的住院患者進(jìn)行了2009甲型H1N1流感病毒和呼吸道合胞病毒(RSV)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，新型流感病毒流行期間，RSV感染仍是住院患兒的主要病因。目前針對(duì)新型流感病毒及其他常見(jiàn)呼吸道病毒感染的關(guān)系，中國(guó)尚未見(jiàn)研究報(bào)道。故本研究選取2009甲型H1N1流感流行期間，H1N1流感病毒檢測(cè)陰性的急性呼吸道感染患兒標(biāo)本，采用多重RT-PCR的方法，檢測(cè)RSVA/B亞型，副流感病毒(PIV)1、2、3型，腺病毒(ADV)和人博卡病毒(HBoV)，以了解2009甲型H1N1流感流行期間，上述呼吸道病毒在北京地區(qū)兒童中的流行特征有否受到甲型H1N1流感病毒流行的影響。

1 方法

1.1 H1N1流感病毒標(biāo)本采集和處理 對(duì)在首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院門診和急診就診的有急性呼吸道感染癥狀、疑似感染2009甲型H1N1流感病毒的患兒(癥狀表現(xiàn):①發(fā)熱＞37.5℃;②無(wú)明顯發(fā)熱，但伴有咽痛、咳嗽、咳痰、流涕、肌痛等癥狀;③發(fā)病7d內(nèi))使用病毒采樣管(海南興南峰醫(yī)藥器械有限公司生產(chǎn))采集咽拭子標(biāo)本。具體方法為:臨床醫(yī)生用專用咽拭子棉簽在患兒咽部左右扁桃體處以適當(dāng)力度旋轉(zhuǎn)擦拭，迅速將棉簽放入裝有3mL病毒采樣液的采集管內(nèi)，棉簽?zāi)┒苏蹟嗖⒎饪?，?℃暫存。同時(shí)登記患兒基本情況(姓名、性別、年齡、家庭住址、聯(lián)系電話、有無(wú)2009甲型H1N1流感接觸史等)及主要癥狀(發(fā)病天數(shù)、有無(wú)發(fā)熱及體溫情況、有無(wú)咽痛、咳嗽、流涕、肌痛等)，標(biāo)本及登記表于12h內(nèi)送至病毒研究室后統(tǒng)一編號(hào)，常規(guī)處理后吸取標(biāo)本液150μL于1.5mLEP管中，采用

QIAamp?Viral RNA Mini Kit(Qiagen，Valencia，USA)試劑盒，具體操作按照說(shuō)明書(shū)，提取病毒核酸。剩余標(biāo)本液吸入2mL凍存管中，于-20℃暫存后，置-80℃長(zhǎng)期保存。

1.2 RSV、PIV、ADV和HBoV標(biāo)本選取原則 ①經(jīng)RTPCR流感病毒檢測(cè)示2009甲型H1N1流感病毒結(jié)果為陰性且內(nèi)參探針信號(hào)為陽(yáng)性者(內(nèi)參探針信號(hào)陰性則認(rèn)為臨床標(biāo)本不合格，予以排除);②患兒基本情況及主要癥狀登記相對(duì)完整;③登記的臨床癥狀符合急性呼吸道感染;④符合上述①～③項(xiàng)，但由于不同月份間2009甲型H1N1流感病毒結(jié)果為陰性的標(biāo)本數(shù)量不等且實(shí)驗(yàn)條件有限，為保證在不同月份標(biāo)本數(shù)相當(dāng)，隨意選取每周20～25個(gè)標(biāo)本。

1.3 RSV、PIV、ADV和HBoV引物、探針的設(shè)計(jì)及合成

RSV檢測(cè)所用探針及引物參照文獻(xiàn)［1］。PIV、ADV和HBoV通過(guò)分析GenBank中相應(yīng)病毒的序列，應(yīng)用DNAStar軟件及Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)適宜的引物及探針:①PIV:在HN基因處，具有PIV 1、2、3型型特異性;②ADV:在六鄰體(Hexon)基因處，包含 ADV1、2、3、5、7、11、14、21型等主要引起呼吸道感染癥狀的常見(jiàn)ADV血清型;③HBoV:設(shè)計(jì)位點(diǎn)在 NS1基因處，型別包含human Bocavirus及human Bocavirus 2和3。RSV、PIV、ADV和HBoV引物及探針均經(jīng)過(guò)BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)分析以確認(rèn)其特異性。同一反應(yīng)管中的多條探針通過(guò)標(biāo)記不同的報(bào)告熒光基團(tuán)以區(qū)別各病原。引物探針由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，具體序列見(jiàn)表1。

1.4 多重RT-PCR檢測(cè)

1.4.1 多重RT-PCR檢測(cè)系統(tǒng)的配液及反應(yīng)條件 本研究采用的多重RT-PCR檢測(cè)分別在3個(gè)系統(tǒng)中進(jìn)行，各反應(yīng)總體積均為25μL，配液及反應(yīng)條件按照說(shuō)明書(shū)操作。所有反應(yīng)均在ABI 7500 Real time PCR儀中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用7500 System SDS Software 1.4進(jìn)行分析。

1.4.2 多重RT-PCR檢測(cè)的敏感度 針對(duì)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)中相應(yīng)病毒靶基因區(qū)域設(shè)計(jì)引物，用該引物對(duì)本實(shí)驗(yàn)室中經(jīng)直接免疫熒光法(DFA)(D3 Ultra DFA Respiratory Virus Screening＆ ID Kit，Diagnostic HYBRIDS，USA)、病毒分離或PCR及測(cè)序法檢測(cè)為病毒陽(yáng)性的相應(yīng)標(biāo)本進(jìn)行目的片段PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)純化后鏈接入T4載體，轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，搖勻后提取質(zhì)粒，用分光光度法測(cè)定產(chǎn)物質(zhì)粒的濃度。每種質(zhì)粒取1μL，用 DEPC水作5倍倍比稀釋(5-3～5-13)，各稀釋濃度以 5μL作為反應(yīng)模板，按照1.4.1所述方法進(jìn)行多重RT-PCR敏感度檢測(cè)。

1.4.3 多重RT-PCR檢測(cè)的特異度 選取用DFA法、病毒分離或PCR加測(cè)序法檢測(cè)常見(jiàn)呼吸道病毒陽(yáng)性的標(biāo)本(包括季節(jié)性流感病毒H1及H3型、RSV A亞型、B亞型，PIV 1、2、3 型，ADV 1、2、3、7、14 型，HBoV，鼻病毒，人偏肺病毒)，及用PCR法檢測(cè)腸道感染病毒陽(yáng)性的標(biāo)本(包括輪狀病毒、柯薩奇病毒A組16型、新型腸道病毒71型、諾如病毒)，提取RNA(ADV、HBoV 提取 DNA)，各取5μL作為模板(先將除ADV和HBoV外的各病毒RNA按照說(shuō)明書(shū)用M-MLV酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄)，分別加入3個(gè)多重檢測(cè)系統(tǒng)中，按照1.4.1所述方法進(jìn)行反應(yīng)特異度檢測(cè)。

1.4.4 標(biāo)本的多重RT-PCR檢測(cè) 將入選的標(biāo)本核酸5μL作為模板，分別加入1.4.1所述反應(yīng)系統(tǒng)中，進(jìn)行標(biāo)本的多重RT-PCR檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以Microsoft Excel 2003處理數(shù)據(jù)圖表。計(jì)數(shù)資料以百分比表示。采用SAS 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)等)。(P＜0.05)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 RSV、PIV、ADV和HBoV引物及探針序列Tab 1 Primers and probes used for RSV，PIV，ADV and HBoV in the multiplex RT-PCR

2 結(jié)果

2.1 多重RT-PCR檢測(cè)的敏感度及擴(kuò)增效率 各反應(yīng)的敏感度及擴(kuò)增效率結(jié)果如表2所示，最低可檢測(cè)目標(biāo)基因含量在10～300拷貝數(shù)。

表2 多重RT-PCR的敏感度及擴(kuò)增效率Tab 2 Sensitivity and amplification efficiency ofthe multiplex RT-PCR

2.2 多重RT-PCR檢測(cè)的特異度 各反應(yīng)均未見(jiàn)非特異性擴(kuò)增曲線，顯示本實(shí)驗(yàn)除了檢測(cè)到目標(biāo)病毒基因外，與其余常見(jiàn)病毒無(wú)交叉反應(yīng)。

2.3 一般情況 依據(jù)本研究選取標(biāo)本的原則選取2009年6月1日至2010年2月28日的標(biāo)本849份，平均每月94份(其中2010年2月為中國(guó)春節(jié)，僅有41份)。男性497例，女性352例，男女比例為1.41∶1。北京地區(qū)患兒占96%(815例)。5歲及以下患兒650例(76.6%)。

2.4 總體檢測(cè)情況RSV、PIV、ADV和HBoV檢測(cè)總陽(yáng)性率為39.0%(331/849份)。男性患兒檢測(cè)陽(yáng)性率為36.0%(179/497)，女性患兒檢測(cè)陽(yáng)性率為43.2%(152/352)，女性檢測(cè)總體陽(yáng)性率略高于男性(P=0.04)。5歲以下患兒占87.6%(290/331)。北京地區(qū)患兒陽(yáng)性標(biāo)本89.1%(295例)。849份標(biāo)本中，RSV-A亞型陽(yáng)性12份(1.4%)，RSV-B亞型陽(yáng)性71份(8.4%)，PIV-1型陽(yáng)性70份(8.2%)，PIV-2型陽(yáng)性4份(0.5%)，PIV-3型陽(yáng)性33份(3.9%)，ADV陽(yáng)性 118份(13.9%)，HBoV陽(yáng)性 23份(2.7%)。各月份檢測(cè)陽(yáng)性率不等(圖1)，以2009年11月最低(23.5%)，2009年12月最高(64.6%)。

2.5 各病毒檢測(cè)陽(yáng)性病例與流行季節(jié)趨勢(shì) 圖2A顯示，RSV高峰季節(jié)為冬季(2009年11月至2010年2月)，流行高峰期間陽(yáng)性檢出率為22.3%(81/363例);RSV-B亞型為優(yōu)勢(shì)亞型，占85.5%(71/83例)。

圖2B顯示，PIV流行以PIV-1型和PIV-3型為主，其中PIV-1型的流行高峰主要在夏秋季(2009年7～10月)，2009年12月時(shí)亦有一小高峰(檢出率為8.8%);PIV-3型的流行高峰主要在夏季前后(2009年6～9月)，PIV-2型主要為夏季散發(fā)。

圖2C顯示，ADV在觀察期間均有較高檢出率，平均為13.9%。2009年12月至2010年2月的冬季似有一小流行峰。HBoV的流行高峰在2009年9～12月。

2.6 各病毒檢測(cè)陽(yáng)性病例的檢出時(shí)間及患兒年齡分布圖3A顯示RSV陽(yáng)性患兒5歲以下比例為A亞型100%(12/12例)，B亞型94.4%(67/71例);圖3B顯示，PIV陽(yáng)性患兒5歲以下比例為 1型84.3%(59/70例)，2型75.0%(3/4例)，3型97.0%(32/33例);圖3C顯示，ADV陽(yáng)性患兒5歲以下占82.2%(97/118例)，進(jìn)一步分析顯示2009年6～11月ADV陽(yáng)性患兒的平均年齡為3.6歲，12月至次年2月患兒的平均年齡降至2.7歲，呈顯著下降趨勢(shì)(P=0.037)。HBoV陽(yáng)性患兒5歲以下比例為95.7%(22/23例)，流行主要在秋季至初冬(2009年6～12月)。

31例患兒標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果為2種病毒同時(shí)陽(yáng)性，未檢出3種及以上病毒同時(shí)陽(yáng)性;雙病毒陽(yáng)性以RSV-B、PIV-1及ADV與其他病毒混合陽(yáng)性的情況較為多見(jiàn);2009年12月雙病毒陽(yáng)性情況檢出最多(11例)，2009年10月無(wú)雙病毒陽(yáng)性情況被檢出。

3 討論

RSV是全球各地引起兒童急性呼吸道感染的重要病原，北京地區(qū)2000至2006年的監(jiān)測(cè)情況［3］顯示，RSV一般從10月開(kāi)始檢出增多，在冬春季(11月至次年4月)有明顯的流行高峰，而5～9月則檢出率很低，感染對(duì)象95%以上為5歲以下的患兒(特別是1歲以內(nèi)的嬰兒)。本研究檢測(cè)的RSV流行高峰和易感人群情況與既往報(bào)道［3］基本吻合。文獻(xiàn)［3］報(bào)道的RSV流行高峰期檢測(cè)陽(yáng)性率為14.0%～42.3%，流行呈現(xiàn)隔年高峰，A、B亞型交替出現(xiàn)的趨勢(shì)。本研究結(jié)果顯示2009至2010年冬季在急性呼吸道感染患兒的咽拭子標(biāo)本中，RSV的陽(yáng)性檢出率為22.3%，流行的優(yōu)勢(shì)亞型為 B亞型，這與文獻(xiàn)報(bào)道［3］的2004至2005年冬春季的流行情況相近。從流行情況看，2009甲型H1N1流感流行期間RSV的流行與往年相比無(wú)明顯差異，基本未受到2009甲型H1N1流感病毒流行的影響。

PIV亦是兒科重要的呼吸道病毒，在嬰幼兒中感染率很高，PIV-1型主要引起兒童上呼吸道感染［4］，而PIV-3型主要引起嬰幼兒的下呼吸道感染［5，6］，PIV-2型多為散發(fā)。北京地區(qū)2001至2003年［5］及2003至2006年［7］PIV 監(jiān)測(cè)的資料顯示北京地區(qū)在急性上呼吸道感染患兒中，PIV的檢測(cè)陽(yáng)性率為13.2%，其中以PIV-1型及PIV-3型為主，流行季節(jié)性不甚明顯，多在每年形成1～2個(gè)較明顯的高峰，PIV-3的流行高峰多在春夏季，PIV-1的流行高峰多在秋冬季，高峰期內(nèi)兩種型別PIV每年都有不同程度的混合流行。本研究顯示PIV的檢測(cè)陽(yáng)性率為12.6%，在2009甲型H1N1流感流行期間形成了2個(gè)較明顯的高峰，第1個(gè)高峰位于2009年6～9月的夏季，PIV-1型和PIV-3型的檢出率均較高(分別為11.8%和7.7%)，第2個(gè)小高峰基本位于2009年12月，以PIV-1型為主(檢出率為8.8%)，PIV-2型僅在夏季有4例散發(fā)。通過(guò)對(duì)比，2009甲型H1N1流感流行期間PIV的流行情況與2003年夏季至2004年春季相近。

鄧潔等［8］在2003至2008年連續(xù)收集北京地區(qū)17 941份急性呼吸道感染患兒的標(biāo)本，通過(guò)病毒分離和(或)間接免疫熒光法進(jìn)行ADV檢測(cè)，測(cè)得的ADV陽(yáng)性率平均為1.69%，監(jiān)測(cè)顯示ADV的流行無(wú)明顯季節(jié)差異，全年均可檢出，偶有散在檢出高峰，5歲以下患兒占84.9%，型別以3型及7型為主。本研究測(cè)得的ADV流行亦無(wú)明顯季節(jié)規(guī)律性，在整個(gè)檢測(cè)區(qū)間內(nèi)均有較高檢出率，平均為13.9%，高于鄧潔等［8］報(bào)道的陽(yáng)性率，此差異主要與檢測(cè)方法不同有關(guān)(RT-PCR檢測(cè)的敏感度普遍高于病毒分離及間接免疫熒光法)。本研究顯示ADV陽(yáng)性患兒5歲以下占82.2%，其中2009年6～11月5歲以下患兒占77.0%，12月至次年2月，5歲以下患兒占86.4%，提示ADV在低年齡組患兒中的流行有較明顯的增加，此期間是否存在ADV流行型別的改變，及其在嬰幼兒中是否存在小規(guī)模的暴發(fā)流行等有待進(jìn)一步監(jiān)測(cè)和研究檢測(cè)印證。

HBoV是Allander等［9］(2005)在人呼吸道標(biāo)本中新檢出的一種病毒，被認(rèn)為主要引起兒童下呼吸道感染［10］，S?derlund-Venermo等［11］研究顯示，在毛細(xì)支氣管炎患兒中，急性HBoV感染率 ＞25%。Lau等［12］研究認(rèn)為HBoV也可引起上呼吸道感染及腸道感染。趙林清等［13］通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，北京地區(qū)嬰幼兒急性呼吸道感染標(biāo)本中HBoV的陽(yáng)性檢出率為4.1%，其中在急性上呼吸道感染患兒標(biāo)本中的檢出率為3.4%，患兒年齡主要集中在5月齡至5歲。本研究中在急性呼吸道感染患兒咽拭子標(biāo)本中HBoV的陽(yáng)性檢出率為2.71%，患兒年齡在8月齡至7歲。有報(bào)道顯示，HBoV的流行季節(jié)多為秋季或冬季，因地區(qū)范圍而略有不同，目前尚無(wú)有關(guān)北京地區(qū)流行季節(jié)的資料，但嚴(yán)華杰等［14］通過(guò)對(duì)上海嘉定地區(qū)2006至2008年連續(xù)3年的監(jiān)測(cè)研究顯示，HBoV的感染高發(fā)季節(jié)為秋冬季(特別是秋季)。本研究結(jié)果顯示2009年9～12月HBoV檢出率升高，提示北京地區(qū)HBoV的高發(fā)季節(jié)亦可能為秋季至初冬。另外該文獻(xiàn)顯示HBoV感染患兒男女比例為2∶1(61/29例)，本研究結(jié)果此比例約為2.28∶1(16/7例)，均提示HBoV在男性患兒中的感染率可能更高。本研究未在＜5月齡患兒標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)HBoV感染，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較為一致，此現(xiàn)象常提示母?jìng)骺贵w保護(hù)作用的存在。鄭敏巧等［15］通過(guò)配對(duì)前瞻性研究認(rèn)為，HBoV IgG抗體可從孕婦經(jīng)胎盤傳給新生兒。但趙林清等［16］通過(guò)分析北京地區(qū)人群中HBoV血清抗體IgG的情況發(fā)現(xiàn)，在＜5月齡嬰兒中，HBoV血清抗體IgG的陽(yáng)性率普遍低于其他各年齡組。因此，低月齡嬰兒中HBoV感染率低的原因及其免疫保護(hù)機(jī)制尚需深入研究。

病毒的核酸檢測(cè)方法快捷方便，是目前病毒檢測(cè)常用方法之一。本研究采用的RT-PCR方法是20世紀(jì)末由美國(guó)Applied Biosystems公司推出的一種新型PCR擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)，其原理是通過(guò)在PCR過(guò)程中引入熒光探針來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)產(chǎn)物擴(kuò)增情況，不需后期處理便可直接對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行客觀判讀。此技術(shù)因敏感度高、特異度強(qiáng)、操作便捷、污染少等優(yōu)點(diǎn)，已被越來(lái)越多的應(yīng)用于病原檢測(cè)領(lǐng)域。特別是近年多重RT-PCR檢測(cè)技術(shù)的不斷成熟［17，18］，與單一反應(yīng)相比更節(jié)省了操作時(shí)間和試劑原料，因此特別適用于大范圍的標(biāo)本篩查、流行病學(xué)監(jiān)測(cè)及珍貴標(biāo)本的多病原分析。在設(shè)計(jì)探針時(shí)，應(yīng)盡量選擇序列保守性高的片段，探針中過(guò)多的引用堿基兼并可能會(huì)影響擴(kuò)增曲線的效率。病毒的核酸檢測(cè)只是病原檢測(cè)的一個(gè)方面，病毒分離培養(yǎng)和血清學(xué)診斷，特別是病毒特異性抗體的檢測(cè)將有助于病原的進(jìn)一步確認(rèn)，上述常用的3種檢測(cè)方法僅代表實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的結(jié)果，應(yīng)該與患兒的臨床癥狀結(jié)合判定，才可進(jìn)行病毒感染性疾病的確診。

本研究應(yīng)用多重RT-PCR的方法，通過(guò)對(duì)2009年6月至2010年2月，北京地區(qū)849例2009甲型H1N1流感病毒檢測(cè)陰性的急性呼吸道感染患兒的咽拭子標(biāo)本進(jìn)行多病原檢測(cè)，結(jié)果顯示:2009甲型H1N1流感流行期間，在急性呼吸道感染患兒中，除新型流感病毒外，其他幾種兒科常見(jiàn)的呼吸道病毒感染仍占40%以上，RSV-B亞型、PIV-1、PIV-3型和ADV是此期間引起兒童急性呼吸道感染的重要病原。通過(guò)分析，RSV、PIV、ADV及 HBoV在2009甲型 H1N1流感流行期間的流行特點(diǎn)與往年相比無(wú)明顯差異，其流行的季節(jié)性基本未受到2009甲型H1N1流感病毒的影響，但各病毒是否存在基因變異則有待進(jìn)一步分子生物學(xué)研究考證。

本研究結(jié)論也存在一定局限性:由于實(shí)驗(yàn)條件有限，僅選取了兒科4種最常見(jiàn)的呼吸道病毒進(jìn)行研究，不能顯示所有的病原譜;隨意選取每周20～25個(gè)標(biāo)本可能會(huì)造成結(jié)果的偏倚。

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