楊 希, 楊艷艷, 張 寧, 王振龍, 李揚(yáng)威, 路紀(jì)琪

(鄭州大學(xué) 生物工程系生物多樣性與生態(tài)學(xué)研究所 河南 鄭州 450001)

0 引言

視覺器官在哺乳動物的所有感覺系統(tǒng)中具有極其重要的意義，有80%的外界信息是通過視覺系統(tǒng)接收、處理和感知的，視覺對動物的生活習(xí)性尤其是取食行為具有重要的影響.地下鼠是一類以植物為食的小型哺乳動物，終生營地下生活[1-2],全世界約有250種地下鼠[3].盡管分布在不同地區(qū)，但因長期棲息于地下黑暗環(huán)境，地下鼠在進(jìn)化中表現(xiàn)出形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能等方面的高度相似性，如視覺系統(tǒng)嚴(yán)重退化，嗅覺和聽覺系統(tǒng)卻高度發(fā)達(dá)[4].地下鼠視覺系統(tǒng)中的成像分析結(jié)構(gòu)、通過視覺誘導(dǎo)行為產(chǎn)生的腦區(qū)退化，而能夠感受不同光照現(xiàn)象的“非成像”視覺系統(tǒng)卻高度發(fā)達(dá)[5].迄今為止，學(xué)者們已對隱鼠(Cryptomyspretoriae)[6]、鼴形鼠(Spalaxehrenbergi)[5]、贊比亞鼴形鼠(Cryptomysanselli)[7]、裸鼢鼠(Heterocephalusglaber)[8]、根田鼠(Microtusoeconomus)[9]和甘肅鼢鼠(Eospalaxcasus)[5]等地下鼠的視覺結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究.

棕色田鼠(Lasiopodomysmandarinus)是一種農(nóng)業(yè)害鼠，營地下生活，與其他地下生活的鼠類相似，其視覺器官亦趨于退化.張育輝等[10]對7種鼠的視覺器官進(jìn)行了比較研究，發(fā)現(xiàn)棕色田鼠的眼球較小，視網(wǎng)膜外核層細(xì)胞的數(shù)目較其他夜行性鼠類少.本文擬通過不同光照對棕色田鼠視覺器官的影響研究，了解棕色田鼠視覺器官組織結(jié)構(gòu)和發(fā)育進(jìn)程特征，揭示光對地上鼠類和地下鼠類視覺發(fā)育影響的不同作用模式，為農(nóng)業(yè)鼠防控提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

1 研究方法

1.1 實驗動物

本研究以棕色田鼠為對象，以昆明小鼠為對照.棕色田鼠活捕自河南省新鄭市農(nóng)田(34 °52 ′N，113 °85 ′E)，于實驗室內(nèi)采用標(biāo)準(zhǔn)小鼠飼養(yǎng)籠單獨(dú)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)房溫度20～24 ℃，光照14L∶10D(光照時間為7∶00-21∶00，40 W燈泡照明).動物飼以大鼠顆粒飼料和兔顆粒飼料(河南省實驗動物中心生產(chǎn))制成的混合飼料，飼料配比為1∶1，另外添加少量新鮮胡蘿卜，供以充足飲水.用于本實驗動物均為健康、成年的棕色田鼠和昆明小鼠.昆明小鼠購自河南省實驗動物中心(合格證號：0003433)，3月齡，單獨(dú)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)管理條件與棕色田鼠相同.

1.2 實驗方法

將實驗動物分成正常光照組和全黑處理組，正常光照組的光照條件為12L∶12D，全黑處理組的光照條件為0L∶24D.各組的母體在正常光照或全黑條件下進(jìn)行飼養(yǎng)和繁殖.子代飼養(yǎng)條件與母體相同，自子鼠出生后第3 d開始，每3 d測一次體重，直到出生后第24 d實驗結(jié)束；各組均于子代出生第6 d,12 d,18 d和24 d測定其眼發(fā)育指標(biāo)，親本于子代斷乳后進(jìn)行相同的測定.每個階段均取3只實驗鼠，頸椎脫臼法處死摘取眼球備用；用游標(biāo)卡尺測量其顱骨長.

1.2.1眼球切片的制作

依據(jù)羅燦嶠等[11]的方法配制眼球標(biāo)本固定液，眼球固定6 h后，沿角膜的邊緣部位剪開并去掉角膜，取出晶狀體，用游標(biāo)卡尺分別測量眼球及晶狀體直徑.隨后常規(guī)石蠟包埋，包埋時進(jìn)行眼球的定位.做過眼球矢狀面的切片，厚度為4 μm，進(jìn)行常規(guī)H-E染色，封片.用Nikon ECL IPSE E200顯微鏡觀察及拍照.

1.2.2視網(wǎng)膜各層厚度及密度的測量

采用顯微照相系統(tǒng)對視網(wǎng)膜各層進(jìn)行拍照，并對各層厚度和細(xì)胞密度進(jìn)行測量.測定方法為：對測量部位拍照，在照片中從需要進(jìn)行細(xì)胞密度測量的視網(wǎng)膜層選取一個點，在該層中沿垂直方向畫線，測量線的長度，對該線所經(jīng)過的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)；細(xì)胞密度(個/mm)=該線所經(jīng)過的細(xì)胞數(shù)量(個)/測量線的長度(mm)，每層重復(fù)測量3次，取平均值.

1.3 數(shù)據(jù)分析

以SPSS 13.0執(zhí)行數(shù)據(jù)處理與分析.采用One-Sample Kolmogorov-Smirnov檢驗所有數(shù)據(jù)分布型，所有數(shù)據(jù)均為正態(tài)分布型；采用線性回歸分析檢驗不同光照與鼠種發(fā)育體重間及不同光照與鼠種眼球、晶狀體和顱骨發(fā)育直徑間的相關(guān)性，利用可重復(fù)測量的雙因素方差(ANOVA)方法分析不同光照與鼠種因素對實驗動物視網(wǎng)膜各層厚度和總厚度及對外核層、內(nèi)核層和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞密度的影響，以F檢驗確定其顯著性.取α=0.05為顯著性臨界值，所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean ± SE)表示.

2 結(jié)果

2.1 不同光照對棕色田鼠和昆明小鼠的眼球直徑發(fā)育的影響

不同光照對棕色田鼠和昆明小鼠眼球直徑發(fā)育的影響不同(圖1).以同物種為組內(nèi)，異物種為組間，結(jié)果表明，在組內(nèi)，不同光照對兩物種眼球直徑發(fā)育的作用差異顯著(P<0.05)；在組間，兩物種間眼球直徑發(fā)育差異顯著(P<0.05)，而不同光照處理的作用則差異不顯著(P>0.05)，物種與不同光照處理間交互作用不顯著(P>0.05).

2.2 不同光照對棕色田鼠和昆明小鼠晶狀體直徑的影響

不同光照對棕色田鼠和昆明小鼠晶狀體直徑發(fā)育的影響不同(圖2).結(jié)果表明，在組內(nèi)均無顯著性影響，在組間，兩物種間晶狀體直徑發(fā)育差異顯著(P<0.01)，而不同光照處理的作用則差異不顯著(P>0.05)，物種與不同光照處理間交互作用不顯著(P>0.05).

2.3 不同光照對棕色田鼠和昆明小鼠色素層發(fā)育的影響

不同光照對棕色田鼠和昆明小鼠色素層發(fā)育的影響不同(圖3).結(jié)果表明，在組內(nèi)差異方面均無顯著性影響，兩物種間色素層發(fā)育的組間差異極顯著(P<0.01)，而不同光照處理的作用則差異不顯著(P>0.05)，物種與不同光照處理間交互作用不顯著(P>0.05).

2.4 不同光照對棕色田鼠和昆明小鼠外核層發(fā)育的影響

不同光照對棕色田鼠和昆明小鼠外核層發(fā)育的影響不同(圖4).結(jié)果表明，在組內(nèi)均無顯著性影響，在組間，兩物種間外核層發(fā)育差異極顯著(P<0.01)，而不同光照處理的作用則差異不顯著(P>0.05)，物種與不同光照處理間交互作用不顯著(P>0.05).

2.5 不同光照對棕色田鼠和昆明小鼠內(nèi)核層發(fā)育的影響

不同光照對棕色田鼠和昆明小鼠內(nèi)核層發(fā)育的影響不同(圖5).結(jié)果表明，在組內(nèi)均無顯著性影響，兩物種間內(nèi)核層發(fā)育的組間差異極顯著(P<0.01)，而不同光照處理的作用則差異不顯著(P>0.05)，物種與不同光照處理間交互作用不顯著(P>0.05).

圖1 不同光照對棕色田鼠和昆明小鼠眼球直徑發(fā)育的影響

圖2 不同光照對棕色田鼠和昆明小鼠晶狀體直徑發(fā)育的影響

圖3 不同光照對棕色田鼠和昆明小鼠色素層發(fā)育的影響

圖4 不同光照對棕色田鼠和昆明小鼠外核層發(fā)育的影響

2.6 不同光照對棕色田鼠和昆明小鼠視網(wǎng)膜發(fā)育的影響

不同光照對棕色田鼠和昆明小鼠視網(wǎng)膜發(fā)育的影響不同(圖6).結(jié)果表明，在組內(nèi)均無顯著性影響.在組間，兩物種間視網(wǎng)膜厚度的發(fā)育差異極顯著(P<0.01)，而不同光照處理的作用則差異不顯著(P>0.05)，但物種與不同光照處理間交互作用顯著(P<0.05).

2.7 不同光照對棕色田鼠和昆明小鼠外核層細(xì)胞密度的影響

不同光照對棕色田鼠和昆明小鼠外核層細(xì)胞密度的影響不同(圖7).結(jié)果表明，在組內(nèi)差異方面均無顯著性影響，兩物種間外核層細(xì)胞密度的組間差異不顯著(P>0.05)，而不同光照處理的作用則差異顯著(P<0.05)，但物種與不同光照處理間交互作用不顯著(P>0.05).

2.8 不同光照對棕色田鼠和昆明小鼠神經(jīng)節(jié)層細(xì)胞密度的影響

不同光照對棕色田鼠和昆明小鼠神經(jīng)節(jié)層細(xì)胞密度的影響不同(圖8).結(jié)果表明，在組內(nèi)差異方面均無顯著性影響，但兩物種間神經(jīng)節(jié)層細(xì)胞密度的組間差異顯著(P<0.05)，而不同光照處理的作用則差異不顯著(P>0.05)，物種與不同光照處理間交互作用不顯著(P>0.05).

3 討論

脊椎動物的視網(wǎng)膜(retina)是由視杯色素層與神經(jīng)層分化而來的，具有色素層、視錐視桿層、外界膜、外核層、外網(wǎng)層、內(nèi)核層、內(nèi)網(wǎng)層、節(jié)細(xì)胞層、神經(jīng)纖維層和內(nèi)界膜等10層基本結(jié)構(gòu)[12-15].地下嚙齒動物具有結(jié)構(gòu)正常的視網(wǎng)膜，但表現(xiàn)出進(jìn)化及退化鑲嵌的結(jié)構(gòu)特點.晝行性和夜行性動物的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)不同，最顯著的差別是外核層細(xì)胞和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)目比例不同，典型晝行性動物的視網(wǎng)膜的外核層和節(jié)細(xì)胞層的細(xì)胞數(shù)量相同，而典型的夜行性動物的外核層細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)大于節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞[16].棕色田鼠的外核層細(xì)胞數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于節(jié)細(xì)胞層的細(xì)胞數(shù)量，表明棕色田鼠視網(wǎng)膜符合夜行性嚙齒動物的基本特征.

圖5 不同光照對棕色田鼠和昆明小鼠內(nèi)核層發(fā)育的影響

圖6 不同光照對棕色田鼠和昆明小鼠視網(wǎng)膜發(fā)育的影響

圖7 不同光照對棕色田鼠和昆明小鼠外核層細(xì)胞密度的影響

圖8 不同光照對棕色田鼠和昆明小鼠神經(jīng)節(jié)層細(xì)胞密度的影響

哺乳動物在剛出生時其視覺系統(tǒng)的發(fā)育尚未完成，仍處于動態(tài)發(fā)育過程中，在出生后由于環(huán)境刺激，視覺系統(tǒng)可進(jìn)行自我調(diào)節(jié)，改變某些結(jié)構(gòu)，這一時期被稱為關(guān)鍵期[17].大鼠在出生第15 d后睜眼，之后才開始接受視覺刺激，環(huán)境的變化才成視覺發(fā)育的主導(dǎo)因素.本研究發(fā)現(xiàn)棕色田鼠在出生15 d左右睜眼，而昆明小鼠比棕色田鼠早一天睜眼.對兩種鼠的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)觀察表明，昆明小鼠在正常光照和黑暗條件下出生后第6 d時，視網(wǎng)膜還未發(fā)育完全，其結(jié)構(gòu)在兩種光照條件下幾乎無差異，外核層與內(nèi)核層幾乎還未分開.而棕色田鼠在出生后第6 d時，雖然黑暗和光照條件下的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)均未發(fā)育完全，但外核層與內(nèi)核層已經(jīng)分化，而在黑暗條件下的分化更為明顯，說明光照對棕色田鼠視網(wǎng)膜的發(fā)育有抑制作用.在正常生理條件下，剛出生時小鼠的視網(wǎng)膜發(fā)育是不完善的，出生后視網(wǎng)膜則表現(xiàn)出從內(nèi)層向外層、從中央向外周的發(fā)育特點.在發(fā)育過程中內(nèi)核層、外核層和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層的細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，細(xì)胞層的厚度也經(jīng)歷著由厚變薄的演變過程[18-22].本研究發(fā)現(xiàn)，昆明小鼠和棕色田鼠的視網(wǎng)膜的發(fā)育也遵循這一發(fā)育規(guī)律，無論在黑暗還是正常光照條件下，兩種鼠的外核層和內(nèi)核層的核層厚度都逐漸由厚變薄.從視網(wǎng)膜總厚度在發(fā)育過程中的變化可見，在黑暗條件下昆明小鼠視網(wǎng)膜的厚度變薄，棕色田鼠呈現(xiàn)相反的變化；在給光刺激的條件下，昆明小鼠的視網(wǎng)膜的厚度有增大的趨勢，而棕色田鼠的視網(wǎng)膜則趨于變薄.這一結(jié)果提示，光刺激對兩種鼠視網(wǎng)膜厚度發(fā)育的作用方式不同，進(jìn)一步證明地上鼠和地下鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)在不同光照下發(fā)育的區(qū)別，反映其不同的進(jìn)化歷程.這種發(fā)育特征的分子機(jī)制尚待進(jìn)一步研究.

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