周 婕， 李穎慧， 邵 紅， 張振中

(1.鄭州大學(xué) 藥學(xué)院 河南 鄭州 450001；2.河南省分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河南 鄭州 450052)

0 引言

苯乙胺類(lèi)腎上腺素能激動(dòng)劑是目前最為常用的平喘藥.該類(lèi)藥物具有苯乙胺的基本結(jié)構(gòu)，大多具有一個(gè)或兩個(gè)手性中心，存在對(duì)映異構(gòu)體，其結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1.對(duì)于含有一個(gè)手性中心的苯乙胺類(lèi)藥物，藥理學(xué)活性通常在R對(duì)映體[1].如克侖特羅有效的為R對(duì)映體，而S對(duì)映體對(duì)療效沒(méi)有貢獻(xiàn)[2]；沙丁胺醇R對(duì)映體藥效比S對(duì)映體強(qiáng)80倍[3]，且在體內(nèi)的吸收率比S對(duì)映體高[4]；班布特羅R對(duì)映體對(duì)丁酰膽堿酯酶的抑制速度是S對(duì)映體的5倍[5].丙卡特羅含有兩個(gè)手性中心，即4個(gè)對(duì)映體，但是作為藥品的外消旋丙卡特羅中僅有2個(gè)對(duì)映體，即(R，S)型和(S，R)型.對(duì)它們進(jìn)行對(duì)映體分離對(duì)于進(jìn)一步研究其藥理和開(kāi)發(fā)副作用更小的新藥有重要的意義.

對(duì)上述藥物的拆分有高效液相色譜法(HPLC)[6]和毛細(xì)管電泳法(CE)[7-9].毛細(xì)管電泳具有手性選擇劑消耗少，運(yùn)行成本低和分離效率高等優(yōu)點(diǎn).β-環(huán)糊精及其衍生物是目前最為常用的手性選擇劑.對(duì)班布特羅、妥洛特羅和丙卡特羅，目前尚未見(jiàn)采用羧甲基-β-環(huán)糊精(CM-β-CD)為手性選擇劑采用毛細(xì)管電泳對(duì)其拆分的文獻(xiàn)報(bào)道.本文以CM-β-CD為手性選擇劑，對(duì)上述5種藥物進(jìn)行手性拆分，并對(duì)影響拆分的因素，如手性選擇劑的種類(lèi)、濃度，緩沖溶液的pH值，分離電壓和柱溫進(jìn)行考察，以確定最佳拆分條件.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Beckman P/ACE MDQ毛細(xì)管電泳儀(二極管陣列檢測(cè)器及32Karat軟件系統(tǒng))，熔融石英毛細(xì)管柱(48.5 cm×75 μm，有效長(zhǎng)度40 cm)(河北永年光導(dǎo)纖維廠)，Millipore 超純水器(美國(guó))，雷磁pHS-3C精密pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，BP211D 1/10萬(wàn)天平(德國(guó)Sartorius公司).

β-環(huán)糊精(β-CD),羧甲基-β-環(huán)糊精(CM-β-CD),三甲基-β-環(huán)糊精(TM-β-CD),羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)(Fluck公司)，二甲基-β-環(huán)糊精(DM-β-CD)(比利時(shí)Acros公司)，鹽酸克侖特羅對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所)，鹽酸班布特羅對(duì)照品(湖南九典制藥有限公司)，鹽酸丙卡特羅對(duì)照品(河南京豫藥業(yè)有限公司)，硫酸沙丁胺醇對(duì)照品(山東省莒南制藥廠)，鹽酸妥洛特羅對(duì)照品(天源精細(xì)化學(xué)品廠)，水為超純水，其他試劑均為分析純.

圖1 5種藥物的結(jié)構(gòu)

1.2 試劑配制

1.2.1樣品溶液配制

精密稱取對(duì)照品2.0 mg，置于10 mL容量瓶中，加超純水稀釋至刻度，即得200 mg·L-1的樣品溶液.

1.2.2緩沖溶液的配制

首先配制50 mmol·L-1的磷酸鹽緩沖液，加入一定量CM-β-CD，得含有一定濃度CM-β-CD的50 mmol·L-1的磷酸鹽緩沖液.然后，用1 mol·L-1磷酸和0.1 mol·L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值，即得具有一定pH值一定濃度CM-β-CD的50 mmol·L-1的磷酸鹽緩沖液.

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

電壓進(jìn)樣方式為10 kV×5 s；工作電壓為20 kV；柱溫為15 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)200 nm；運(yùn)行緩沖液：含10 mmol·L-1CM-β-CD的50 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液 (pH為3.5).使用前用0.1 mol·L-1氫氧化鈉沖洗30 min，超純水和緩沖液分別沖洗10 min；每次運(yùn)行前用0.1 mol·L-1氫氧化鈉、超純水和緩沖液分別沖洗3 min.

2 結(jié)果與討論

2.1 手性選擇劑的影響

分別以β-CD、CM-β-CD、DM-β-CD、TM-β-CD 和HP-β-CD作為手性選擇劑，在同一條件下，研究它們對(duì)上述5種藥物手性分離的影響.以含10 mmol·L-1環(huán)糊精的50 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液 (pH為3.5)為背景電解質(zhì)，分離電壓為20 kV，柱溫為15 ℃.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，β-CD對(duì)克侖特羅、妥洛特羅和丙卡特羅存在手性選擇性，其中，克侖特羅和丙卡特羅在此條件下達(dá)到了基線分離，TM-β-CD僅對(duì)妥洛特羅存在手性選擇性.DM-β-CD、HP-β-CD和CM-β-CD對(duì)5種藥物都存在手性選擇性.在此條件下，DM-β-CD使克侖特羅和丙卡特羅達(dá)到基線分離，HP-β-CD使丙卡特羅達(dá)到基線分離.采用CM-β-CD時(shí)，5種藥物均達(dá)到了基線分離，且分離度較大，其中丙卡特羅的分離度達(dá)到了25.37.因此，本文選擇CM-β-CD為手性選擇劑.

2.2 緩沖液pH值的影響

本文所研究的5種藥物為堿性化合物，可以質(zhì)子化為陽(yáng)離子，其電泳方向與電滲流同向.采用pH值較低的酸性緩沖液做背景電解質(zhì)，可以抑制電滲流和減小毛細(xì)管壁的吸附，使分離度得到提高.因此，本文選擇pH為2.5～6.5，以考察pH值對(duì)5種藥物對(duì)映體分離的影響.

CM-β-CD是一種陰離子修飾的環(huán)糊精，在緩沖液中因電離而變?yōu)閹в胸?fù)電荷的陰離子，其電泳方向與手性分子相反.pH值在2.5～6.5范圍內(nèi)，被分離樣品的質(zhì)子化程度隨pH值的升高而逐漸減小，CM-β-CD的電離度迅速增加，兩者之間相互作用的幾率顯著增加.由于電滲流隨著pH值的升高而增大，使被分離樣品與CM-β-CD在毛細(xì)管柱的遷移時(shí)間縮短，較高的pH值反而不利于對(duì)映體的分離，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在pH值為3.5時(shí)，手性分離效果最好，5種藥物均達(dá)到了基線分離(見(jiàn)圖2).

圖2 5種藥物的拆分電泳圖

2.3 手性選擇劑濃度的影響

為了研究CM-β-CD濃度對(duì)拆分的影響，分別考察了濃度為1,5,10和15 mmol·L-1時(shí)的情況(圖3).當(dāng)CM-β-CD濃度從5 mmol·L-1升高到10 mmol·L-1時(shí)，5種藥物的分離度都有明顯的改善，且遷移時(shí)間適中.當(dāng)CM-β-CD濃度從10 mmol·L-1升高到15 mmol·L-1時(shí)，僅班布特羅的分離度有明顯改善，其他藥物的分離度雖有改善，但并不明顯，且由于CM-β-CD濃度增大，引起遷移時(shí)間延長(zhǎng)，不利于分析.因此，選擇10 mmol·L-1為拆分劑濃度.

圖3 CM-β-CD濃度對(duì)分離的影響

2.4 分離電壓的影響

以含10 mmol·L-1CM-β-CD的50 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液 (pH為3.5)為背景電解質(zhì)，考察分離電壓為15～25 kV.對(duì)班布特羅，20 kV時(shí)分離度較好，且遷移時(shí)間適中.25 kV時(shí)電流較大，由此引起的焦耳熱增加，影響分離效果，對(duì)其他藥物也有類(lèi)似的現(xiàn)象.因此，選擇20 kV為分離電壓.

2.5 柱溫的影響

以含10 mmol·L-1CM-β-CD的50 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液 (pH為3.5)為背景電解質(zhì)，考察柱溫分別為15，20,25 ℃對(duì)分離的影響.隨柱溫的升高，各對(duì)映體的遷移時(shí)間逐漸減小，這是因?yàn)闇囟壬呤沟镁彌_溶液的黏度降低，對(duì)映體的表觀電泳遷移率增大所致.隨著溫度的降低，分離度增大.說(shuō)明手性藥物與CM-β-CD形成包結(jié)絡(luò)合物的過(guò)程是一個(gè)放熱過(guò)程，降低溫度有利于包結(jié)絡(luò)合物的形成，進(jìn)而有利于對(duì)映體的分離.因此，選擇柱溫為15 ℃.

2.6 手性拆分機(jī)理的探索

環(huán)糊精及其衍生物分離對(duì)映構(gòu)體的機(jī)理研究尚未成熟,目前關(guān)于拆分機(jī)理的解釋主要有：包含機(jī)理(或締合機(jī)理)，即對(duì)映體分子和CD 及衍生物形成程度不同的包絡(luò)物,而使它們分離；誘導(dǎo)作用機(jī)理，當(dāng)手性分子靠近CD 時(shí),對(duì)手性區(qū)域的基團(tuán)產(chǎn)生誘導(dǎo)作用,具有合適構(gòu)象的手性分子[10]的這種作用較強(qiáng)，根據(jù)作用強(qiáng)度的不同而使對(duì)映體分離；主客體相互作用機(jī)理，即CD 與手性分子之間存在氫鍵,偶極-偶極相互作用以及范德華力等,這些作用力對(duì)對(duì)映體的拆分均有影響[11-12].

環(huán)糊精是環(huán)形低聚糖分子,具有外親水、內(nèi)疏水性質(zhì)， 溶液中對(duì)映體分子可以根據(jù)CD 分子空間手性環(huán)境,選擇性地進(jìn)入CD分子空穴,形成一種包合絡(luò)合物,然后通過(guò)電泳遷移速度差異的增加達(dá)到拆分目的[11-12].根據(jù)拆分結(jié)果及苯乙胺類(lèi)藥物的結(jié)構(gòu),該拆分機(jī)理可能是包含機(jī)理和主客體相互作用機(jī)理相結(jié)合,即被拆分化合物的疏水部分苯環(huán)進(jìn)入CM-β-CD 內(nèi),手性碳上的—OH 與CM-β-CD空穴外的—COOH 形成氫鍵,而—N也與—OH 形成氫鍵.但是由于手性藥物手性中心在空間的取向不同，而CM-β-CD形成配合物的穩(wěn)定常數(shù)不同,旋光活性物質(zhì)的表觀遷移速度產(chǎn)生差別而分離.

3 結(jié)論

通過(guò)比較各種手性選擇劑的拆分效果，選擇CM-β-CD為手性選擇劑，并確立了最佳拆分條件：以含10 mmol·L-1CM-β-CD的50 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液 (pH為3.5)為背景電解質(zhì)，分離電壓為20 kV，柱溫為15 ℃，并且對(duì)苯乙胺類(lèi)藥物的手性拆分機(jī)理進(jìn)行了初步探討.

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