劉學(xué)東，王志亮，包振民

（1.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物遺傳與種質(zhì)工程實(shí)驗(yàn)室，山東青島266003；2.青島市市立醫(yī)院呼吸科，山東青島266003；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物檢疫所外來(lái)病中心，山東青島266033）

禽流感病毒抗原表位分析及H5N1亞型基因工程疫苗設(shè)計(jì)＊

劉學(xué)東1，2，王志亮3，包振民1＊＊

（1.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物遺傳與種質(zhì)工程實(shí)驗(yàn)室，山東青島266003；2.青島市市立醫(yī)院呼吸科，山東青島266003；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物檢疫所外來(lái)病中心，山東青島266033）

以亞洲地區(qū)H5N1亞型禽流感病毒（Avian Influenze Virus）流行株為研究對(duì)象，利用計(jì)算機(jī)軟件，對(duì)同源性較高的HA1（Hemagglutnin，HA，血凝素）和NP（Nucleocapsid protein，核衣殼蛋白）進(jìn)行全基因序列分析，優(yōu)選出HA1蛋白的主要T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位，以及NP蛋白的主要CTL（Cytotoxicity T lymphocyte，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞）表位。依據(jù)這些優(yōu)選表位，設(shè)計(jì)了禽流感病毒H5N1亞型基因工程疫苗。構(gòu)建了基因工程疫苗表達(dá)載體pRSET－AIV，外源基因能夠在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中得到良好表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物免疫小鼠后，血清中Ig A和IgG抗體水平明顯上升，在體外培養(yǎng)脾細(xì)胞可產(chǎn)生IL－2、IL－4和IFN－γ細(xì)胞因子。驗(yàn)證了該H5N1亞型基因工程疫苗的抗原性，證實(shí)該基因工程疫苗在免疫小鼠體內(nèi)激發(fā)體液免疫的同時(shí)調(diào)動(dòng)了細(xì)胞免疫。

禽流感；基因工程疫苗；抗原表位；H5N1

禽流感（Avian Influenze，AI）是1種禽類的烈性傳染病，人類也是禽流感病毒的易感宿主。目前疫苗的研究和應(yīng)用是控制禽流感的主要措施。其中禽流感表位疫苗的研究是最為主要的熱點(diǎn)［1－2］，禽流感病毒表面蛋白HA上有很多抗原表位［3］，能特異地與T細(xì)胞抗原受體（T cell receptor，TCR）和B細(xì)胞抗原受體（B cell receptor，BCR）結(jié)合的T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位［4－5］。將T、B細(xì)胞表位以特定的方式注入機(jī)體，可誘導(dǎo)有效免疫應(yīng)答。但現(xiàn)有的表位多肽疫苗分子過(guò)小，單獨(dú)使用時(shí)，易降解，免疫原性較弱，難以誘導(dǎo)強(qiáng)而持久的免疫應(yīng)答。因此，本研究通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)了以HA主要B細(xì)胞抗原表位為主體，以特異性和非特異性T細(xì)胞表位為輔的新型H5N1亞型禽流感基因工程疫苗。該疫苗理論上具有亞單位疫苗的優(yōu)勢(shì)，能夠充分調(diào)動(dòng)機(jī)體的體液免疫，而且由于添加了特異性和非特異性T細(xì)胞表位，還能賦予該疫苗調(diào)動(dòng)機(jī)體細(xì)胞免疫的能力，從而對(duì)不同亞型的禽流感病毒具有一定交叉保護(hù)能力。該疫苗的設(shè)計(jì)綜合了禽流感亞單位疫苗和表位疫苗的優(yōu)點(diǎn)，具有互補(bǔ)性，能有效彌補(bǔ)亞單位疫苗和表位疫苗各自的不足。

1 材料方法

1.1 國(guó)內(nèi)流行H5N1毒株的HA和NP蛋白序列的選擇

利用Influenza Sequence Database和NCBI的Blast和Tree分析比較國(guó)內(nèi)H5N1流感病毒的HA和NP蛋白序列，選擇2004年以來(lái)發(fā)表的擁有共同序列最多、Blast分析同源性最高（與中國(guó)及周邊國(guó)家，尤其是東南亞國(guó)家發(fā)表H5N1毒株序列相比）的HA1蛋白和NP蛋白，作為表位分析和疫苗設(shè)計(jì)的參照序列。

1.2 MHC II細(xì)胞表位及CTL表位的選擇

利用Net MHCII2.1對(duì)選定HA1蛋白進(jìn)行CD4＋T細(xì)胞表位分析；利用NetCTL1.2 NP蛋白進(jìn)行CTL表位分析，各類Subtype的表位各選擇1個(gè)，選擇標(biāo)準(zhǔn)：（1）C端被蛋白酶體處理分值大于0.5；（2）TAP轉(zhuǎn)送分值大于0.5；（3）對(duì)已有文獻(xiàn)報(bào)道確認(rèn)的CTL表位也予以選擇。

1.3 禽流感病毒H5N1亞型基因工程疫苗蛋白結(jié)構(gòu)與編碼基因設(shè)計(jì)

含有CD4＋T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位的HA1置于疫苗N端，在其C端連接CTL表位。CTL表位兩端多帶1個(gè)該表位在NP蛋白中相鄰的氨基酸，將這些表位合理連接，然后整體分析，選擇不產(chǎn)生高分值連接表位的CTL表位串接設(shè)計(jì)，獲得 疫苗氨基酸序列，再利用infor Max公司的Vector NTI 8.0的Back Translation功能選擇Escherichia coli的Codon Usage Table，獲得禽流感病毒H5N1亞型基因工程疫苗蛋白編碼基因，再根據(jù)大腸桿菌優(yōu)勢(shì)密碼子進(jìn)行A、T、G、C的平衡，并控制編碼基因中常用酶切位點(diǎn)，最終獲得該禽流感病毒H5N1亞型基因工程疫苗蛋白編碼基因，基因由上海捷瑞生物工程有限公司合成并行DNA序列測(cè)定。

1.4 工程疫苗的表達(dá)及目的蛋白純化復(fù)性

用PstⅠ＋HindⅢ雙酶切消化人工合成的H5N1亞型基因工程疫苗編碼基因，酶切片段插入p RSET B表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建工程疫苗的表達(dá)載體p RSETAIV，測(cè)序驗(yàn)證；將含有p RSET－AIV質(zhì)粒的大腸桿菌BL21（DE3）菌株用1 mmol／L IPTG誘導(dǎo)3 h，以表達(dá)H5N1亞型基因工程疫苗；離心收集菌體，超聲波破碎，沉淀以6 mol／L鹽酸胍，20 mmol／L Tris－HCl（p H＝8.0），0.3%β－ME充分溶解后，以Ni＋親和柱對(duì)目的蛋白進(jìn)行吸附，8 mol／L尿素，20 mmol／L Tis－HCl，200 mmol／L咪唑，0.1%β－ME洗脫，收集洗脫峰。采取稀釋復(fù)性的方法對(duì)禽流感病毒H5N1亞型基因工程疫苗進(jìn)行復(fù)性。

1.5 基因工程疫苗的免疫效力檢測(cè)

將復(fù)性好的蛋白疫苗以PBS配制成40μg／mL的蛋白溶液，分別以等體積ISA 50V2佐劑和不完全福氏佐劑進(jìn)行乳化制成疫苗。選取正常體重約20 g昆明種小鼠12只，隨機(jī)分為A、B 2組，A組以ISA 50V2佐劑乳化的疫苗免疫，20μg／只，并分別于免疫后3、5周，用相同劑量不完全福氏佐劑乳化疫苗加強(qiáng)免疫1次；B組為PBS對(duì)照組。每次免疫的7 d后斷尾采血，以方法1.4所獲抗原蛋白包被酶標(biāo)板，5μg／孔，ELISA（抗體購(gòu)自SIGMA公司）檢測(cè)小鼠血清中IgG和Ig A抗體水平。

1.6 免疫小鼠的細(xì)胞因子水平檢測(cè)

將方法1.5中免疫6周后的小鼠，引頸處死，無(wú)菌條件下摘取脾臟，分離脾細(xì)胞，以1×106個(gè)／孔的密度接種入24孔板中，平行接種6孔，向其中3孔中分別加入100μL（0.1μg）疫苗蛋白，其他3孔中加入100 μL PBS作為空白對(duì)照，于CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h后，收集培養(yǎng)上清，ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL－2、IL－4和IFN－γ的含量（試劑盒為Adlitteram Diagnostic laboratories公司產(chǎn)品）。

2 結(jié)果

2.1 國(guó)內(nèi)流行H5N1毒株的HA和NP蛋白序列的選擇

經(jīng)過(guò)大量的序列比對(duì)工作，最終選擇了中國(guó)2004年在華東、河北、河南、廣東和廣西發(fā)現(xiàn)的流行毒株的HA1作為疫苗設(shè)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)參照序列（該序列Gene－Bank收錄號(hào)：Q80A26）；NP蛋白序列則選擇了大陸和香港高同源性的序列作為標(biāo)準(zhǔn)參照序列（該序列Gene－Bank收錄號(hào)：Q6J8B1）。

2.2 HA1蛋白的MHC II表位和NP蛋白的CTL表位分析及H5N1亞型基因工程疫苗蛋白結(jié)構(gòu)

利用Net MHCII2.1 server對(duì)選定的HA1蛋白進(jìn)行MHC II表位預(yù)測(cè)分析后，發(fā)現(xiàn)本研究所選擇的流行毒株的HA1蛋白其中包含多種強(qiáng)勢(shì)MHC II型T細(xì)胞表位，因此直接選用原HA1蛋白序列，沒有再添加額外的通用型T細(xì)胞表位；而對(duì)選定的NP蛋白進(jìn)行分析后，共篩選出了5個(gè)CTL表位應(yīng)用于疫苗設(shè)計(jì)中。最終獲得的全新禽流感表位疫苗氨基酸序列如下：

DQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTH

AQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLILRDCS

VAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKA

SPANDLCYPGDFNDYEELKHLLSRINH

FEKIQIIPKSSWSNHEASSGVSSACPY

LGKSSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKRSY

NNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTR

LYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATR

SKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAIN

FESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSAIMKSE

LEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFHNIH

PLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNGYSLV

GIDPFRLLQNSQVFSLIRPNENPAHKSWH

SNLNDATYQRTRALVRTGRMVSGIG

RFYVWMASHSAAFEDLRVSSMEAMD

SNTLELRSRYWAIRTR

2.3 H5N1亞型基因工程疫苗的表達(dá)、純化

將構(gòu)建正確的p RSET－AIV質(zhì)粒的大腸桿菌BL21（DE3）菌株在經(jīng)過(guò)1 mmol／L IPTG誘導(dǎo)3 h后，在預(yù)期分子量45k D處有明顯新生條帶出現(xiàn)（見圖1），表明外源基因能夠在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中得到良好表達(dá)。經(jīng)過(guò)細(xì)胞破碎后離心，目的蛋白以包涵體形式存在于沉淀中，Ni＋親和純化后，目的蛋白純度可達(dá)95.5%（見圖1）。

圖1 重組AIV疫苗純化蛋白SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳圖Fig.1 SDS－PAGE of purified recombinant AIV vaccine

2.4 免疫小鼠血清中的Ig A抗體和IgG抗體水平

免疫小鼠血清中Ig A和IgG抗體檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，注射H5N1亞型基因工程疫苗的免疫小鼠血清中的抗體水平明顯上升。

圖2 ELISA檢測(cè)不同免疫期Ig A和IgG抗體水平Fig.2 Induced Ig A and Ig Gtitres in different immunizing periods（detected by ELISA）

2.5 H5N1亞型基因工程疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞因子反應(yīng)

在檢測(cè)的各種細(xì)胞因子中，在體外培養(yǎng)脾細(xì)胞中加入純化的抗原蛋白后可有效刺激IL－2、IL－4和IFN－γ產(chǎn)生，具體數(shù)值見表1（P＜0.05，n＝3）。其中IL－2和IL－4的增高最為明顯。

表1 體外培養(yǎng)的小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子水平Table 1 In vitro cytokine levels in spleen cells from mouse／pg·m L－1

3 討論

在禽流感疫苗設(shè)計(jì)過(guò)程中，為了保證所設(shè)計(jì)疫苗的有效性和廣譜性，本研究首先對(duì)近年來(lái)流行的禽流感病毒H5N1亞型的HA和NP蛋白進(jìn)行了數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)和序列分析，確定了禽流感HA1和NP蛋白的參考序列，所選擇的HA參考序列與國(guó)內(nèi)和周邊地區(qū)的流行毒株序列一致性高于95%，相似性大于97%，該序列與國(guó)內(nèi)7個(gè)不同地域的流行毒株發(fā)表序列完全一致，進(jìn)化樹分析顯示該序列與目前國(guó)內(nèi)使用的疫苗株HA1蛋白序列同源性很高，具很高的可信度；在NP蛋白序列比對(duì)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)NP蛋白序列相對(duì)保守，國(guó)內(nèi)流行的H5N1毒株NP蛋白一致性高達(dá)98%，因此選擇了基因庫(kù)中中國(guó)大陸和香港一致序列最多的NP蛋白序列作為疫苗設(shè)計(jì)的NP蛋白參考序列。

MHC分子是TCR識(shí)別病毒蛋白T細(xì)胞表位的基礎(chǔ)［6］，在疫苗中引入覆蓋多種DR類型的MHCⅡ表位是目前改善亞單位疫苗的免疫效果的重要手段，目前禽類MHCⅡ分子結(jié)構(gòu)、功能及其相關(guān)性研究較欠缺，應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)來(lái)預(yù)測(cè)禽流感病毒抗原T細(xì)胞表位的研究目前較少。本研究利用計(jì)算機(jī)輔助預(yù)測(cè)法對(duì)所確定的禽流感HA1和NP蛋白參考序列進(jìn)行了表位分析，發(fā)現(xiàn)HA1分子內(nèi)含多個(gè)可與MHCⅡ多個(gè)DR類型高效結(jié)合的強(qiáng)勢(shì)T細(xì)胞表位，其中有部分表位已有文獻(xiàn)支持［7－8］。另外，為了平衡調(diào)動(dòng)免疫個(gè)體的體液免疫和細(xì)胞免疫，研究中還對(duì)選定的禽流感HA1和NP蛋白參考序列進(jìn)行了CTL強(qiáng)勢(shì)表位計(jì)算機(jī)輔助分析，選取了5個(gè)高親和力CTL表位作為疫苗設(shè)計(jì)中的重要元件，其中部分CTL表位已被證明具有調(diào)動(dòng)特異性細(xì)胞免疫的效果［9－10］。

考慮到禽流感病毒變異快，易于逃避宿主免疫防御，研究中選擇了多個(gè)抗原上的多個(gè)表位來(lái)刺激機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫，使機(jī)體具有較廣泛的免疫保護(hù)能力［11］，將含有主要保護(hù)性B細(xì)胞表位和覆蓋多種DR類型的MHCⅡ表位的H5N1病毒HA1蛋白作為疫苗的主體骨架，使其具備了亞單位疫苗的特性；同時(shí)在該骨架C端又引入了從比較保守的NP蛋白的CTL細(xì)胞表位，不但能夠加強(qiáng)該疫苗的細(xì)胞免疫能力，而且能夠提高該疫苗抵抗H5N1變異株免疫逃逸的能力，最終形成了Th細(xì)胞表位＋B細(xì)胞表位＋CTL表位的多表位串聯(lián)型全新抗原結(jié)構(gòu)，同時(shí)優(yōu)化了B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位的相對(duì)定位；在CTL表位間的間隔序列優(yōu)化設(shè)計(jì)中，主要利用CTL表位兩端多帶1個(gè)該表位在NP蛋白中相鄰的氨基酸，連接后整體分析，選擇不產(chǎn)生高分值連接表位的CTL表位串接設(shè)計(jì)，最終完成了整個(gè)疫苗全序列的設(shè)計(jì)。該疫苗最終在大腸桿菌BL21中獲得了高效表達(dá)。進(jìn)一步的小白鼠實(shí)驗(yàn)充分驗(yàn)證了該H5N1亞型基因工程疫苗的抗原性，同時(shí)，該疫苗可引起小白鼠體內(nèi)細(xì)胞因子水平的變化，證明在激發(fā)體液免疫的同時(shí)也調(diào)動(dòng)了細(xì)胞免疫。

本文研究表明了禽流感H5N1亞型基因工程疫苗具有很強(qiáng)的免疫效力，基于基因工程的自身優(yōu)勢(shì)，該疫苗可以作為以防御禽流感疫病高致病性毒株為主低致病性毒株為輔的新型復(fù)合疫苗進(jìn)行進(jìn)一步的研究開發(fā)。

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Analysis of Avian Influenza Virus Epitopes and the Design of H5N1 Virus Genetic Engineering Vaccine

LIU Xue－Dong1，2，WANG Zhi－Liang3，BAO Zhen－Min1
（1.Genetics and Breeding Laboratory，Ocean University of China，Qingdao 266003，China；2.Respiratory Department of Qingdao Municipal Hospital，Qingdao 266003，China；3.National Diagnostic Center for Exotic Animal Diseases，Ministry of Agriculture of the Peoples Republic of China，Qingdao 266033，China）

In this study，we choose the asian H5N1 subtype avian influenza virus，use software to analyze the gene sequences of the HA1（Hemagglutnin，HA，hemagglutinin）and NP（Nucleocapsid protein，capsid protein），and optimize major Tcellepitopes and Bcell epitopes of the HA1 protein and the major CTL（Cytotoxicity Tlymphocyte cytotoxic T lymphocyte）epitope of the NP protein.According to these preferred epitopes，we designed the avian influenza virus subtype H5N1 recombinant vaccine.Genetically engineered vaccine expression vector p RSET－AIV was constructed，exogenous gene can be well expressed in E.coli system.Mice immunized with expression products，serum Ig A and IgG antibody levels were significantly increased，IL－2，IL－4 and IFN－γcytokines were tested in vitro spleen cells.The antigen of genetic engineering was verified.It's confirmed that the vaccine stimulates the cellulat's immunity while it activates the humoral immunity.

avian influenza；vaccine；epitope；H5N1

Q812

A

1672－5174（2012）04－055－04

2011－06－15；

2011－09－13

劉學(xué)東（1969－），女，博士，碩導(dǎo)，從事呼吸科臨床工作及細(xì)菌學(xué)研究。E－mail：xuedongliu＠263.net

＊＊通訊作者：E－mail：zmbao＠ouc.edu.cn

責(zé)任編輯 朱寶象