鄭 涓，王發(fā)松，*，羅慶林

(1.湖北民族學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 恩施 445000;2.重慶恒星生物技術(shù)有限責(zé)任公司,重慶 黔江 409000)

喜樹(shù)堿(Camptothecin，CPT)是一種含有內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)的吲哚類生物堿，其具有顯著的抗癌活性[1]，也是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一通過(guò)拓?fù)洚悩?gòu)酶發(fā)揮細(xì)胞毒性的天然活性成分[2].喜樹(shù)堿最早是從珙桐科植物喜樹(shù)(CamptothecinacuminateDecne)中分離得到[1]，但據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道喜樹(shù)中喜樹(shù)堿的含量較低，一般都在0.01%～0.1%之間[3-7]，而茶茱萸科植物馬比木〔Nothapodytespittosporoides(Oliv.) sleum.〕根中喜樹(shù)堿的含量相對(duì)較高，一般都在0.1%～0.4%之間[8-10].在武陵山區(qū)有較大儲(chǔ)量的馬比木植物資源.本文通過(guò)以馬比木為原料，研究喜樹(shù)堿的最優(yōu)提取工藝，為武陵山區(qū)中開(kāi)發(fā)利用馬比木植物資源奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料：馬比木(Nothapodytespittosporoides)的根采自重慶黔江.切片，陰干后于提取前粉碎.

主要試劑：甲醇(分析純)，乙腈(色譜純)，喜樹(shù)堿對(duì)照品(純度為98.5%).

1.2 主要儀器

提取工藝各因素考察采用單因素法和正交試驗(yàn)法，含量測(cè)定采用HPLC法.分析用高效液相色譜儀為安捷倫1120型.

1.3 HPLC方法學(xué)考察

1.3.1 色譜條件 色譜柱為Agilent TC-C18(5 μm,250 mm×4.6 mm) ；流動(dòng)相為乙腈：水(40∶60)；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL；柱溫為室溫.

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取喜樹(shù)堿標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，用甲醇定容至50 mL，得濃度為0.1 mg/mL的喜樹(shù)堿標(biāo)準(zhǔn)液.分別取標(biāo)準(zhǔn)液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL置于10 mL的容量瓶中，加甲醇定容于刻度，搖勻，分別在1.3.1節(jié)所述色譜條件下進(jìn)樣分析.以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，喜樹(shù)堿濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得線性回歸方程為：Y=886 628X+1×106，相關(guān)系數(shù)R=0.999 7，線性范圍為：0.02～0.18 mg/mL.

1.3.3 樣品測(cè)定 精密稱取馬比木根的干燥粉末10 g，加入100 mL甲醇，70℃水浴中加熱回流1 h，得樣品提取液；將提取液轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，定容；在1.3.1節(jié)所述色譜條件下進(jìn)樣，得峰面積，代入1.3.2節(jié)所述線性回歸方程中，得到樣品喜樹(shù)堿含量，再計(jì)算得出喜樹(shù)堿提取率.

1.3.4 精密度試驗(yàn) 取同一標(biāo)準(zhǔn)溶液，在1.3.1節(jié)所述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)得喜樹(shù)堿含量，計(jì)算RSD值為2.6%.

1.3.5 重現(xiàn)性試驗(yàn) 精密稱取5份馬比木根的干燥粉末10 g，通過(guò)1.3.3節(jié)所述樣品測(cè)定方法測(cè)定喜樹(shù)堿含量,并計(jì)算RSD值為1.2%.

1.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 同一份樣品提取液，在1.3.2節(jié)所述色譜條件下，分別在2、4、8、12、48 h時(shí)各進(jìn)樣一次，測(cè)得喜樹(shù)堿含量，計(jì)算RSD值為3.1%.

1.3.7 加標(biāo)回收率試驗(yàn) 精密稱取5份馬比木根的干燥粉末10 g，通過(guò)1.3.3節(jié)所述樣品測(cè)定方法得到樣品提取液，分別加入0.02 mg/mL的喜樹(shù)堿標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，在1.3.2所述色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得加標(biāo)回收率為97.4%.

表1 甲醇濃度對(duì)喜樹(shù)堿提取率影響

表2 溫度對(duì)喜樹(shù)堿提取率的影響

表3 時(shí)間對(duì)喜樹(shù)堿提取率的影響

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 甲醇濃度對(duì)提取率的影響 精密稱取5份馬比木根的干燥粉末10 g，分別加入50%、60%、70%、80%、90%的甲醇100 mL，70℃水浴中加熱回流1 h，重復(fù)提取三次，分別編號(hào)1、2、3，并計(jì)算喜樹(shù)堿的平均提取率，如表1所示.

2.1.2 溫度對(duì)提取率的影響 精密稱取5份馬比木根的干燥粉末10 g，加入70%的甲醇100 mL，分別在40、50、60、70、80℃水浴中加熱回流1 h，重復(fù)提取三次，分別編號(hào)1、2、3，并計(jì)算喜樹(shù)堿的平均提取率，如表2所示.

2.1.3 時(shí)間對(duì)提取率的影響 精密稱取5份馬比木根的干燥粉末10 g，加入70%的甲醇100 mL，分別在70℃水浴中回流0.5、1.0、1.5、2、2.5 h，重復(fù)提取三次分別編號(hào)1、2、3并計(jì)算喜樹(shù)堿的平均提取率，如表3所示.

由單因素試驗(yàn)可知，在低濃度下隨甲醇濃度的升高提取率逐漸提高，可能是因?yàn)橄矘?shù)堿在甲醇中溶解度比在水中溶解度大；而超過(guò)70%后，隨甲醇濃度的升高，提取率逐漸降低，這可能是因?yàn)楦邼舛鹊募状疾焕诖┩讣?xì)胞導(dǎo)致的結(jié)果.

在溫度較低時(shí)，隨溫度的升高提取率逐漸提高，這可能是因?yàn)樯邷囟瓤梢蕴岣哂行С煞衷谌軇┲械臄U(kuò)散速率，使得提取率有所升高，但是超過(guò)70℃之后，可能是因?yàn)橄矘?shù)堿本身具有熱不穩(wěn)定性，過(guò)高的溫度促使其分解，使得提取率下降.

提取過(guò)程中，喜樹(shù)堿隨提取時(shí)間延長(zhǎng)提取率逐漸提高，但是超過(guò)1.5 h后，可能由于喜樹(shù)堿本身分解損失，導(dǎo)致提取率減低.

表4 L9(33)正交試驗(yàn)因素水平表

表6 方差分析結(jié)果

2.2 正交試驗(yàn)

通過(guò)單因素試驗(yàn)，選取提取溶液濃度、提取溫度、提取時(shí)間三個(gè)因素設(shè)計(jì)三因素三水平的正交試驗(yàn)，見(jiàn)表4；采用L9(33)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以喜樹(shù)堿提取率為考察指標(biāo)，結(jié)果及分析見(jiàn)表5.

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

精密稱取馬比木根的干燥粉末10 g，共9份，置于250 mL圓底燒瓶中，按表4進(jìn)行試驗(yàn)，采用HPLC進(jìn)樣分析提取液中喜樹(shù)堿的濃度，并計(jì)算出喜樹(shù)堿的提取率.正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析見(jiàn)表5及表6.

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)比較表5中R(極差)值的大小，各因素極差大小為RB>RA>RC，優(yōu)先順序?yàn)锽>A>C.

由表6的方差結(jié)果可知，在提取喜樹(shù)堿的過(guò)程中甲醇濃度和提取溫度對(duì)提取率有顯著影響，而提取時(shí)間對(duì)提取率影響不顯著.對(duì)于工藝化生產(chǎn)中，優(yōu)化條件為A2B2C2，即甲醇濃度為70%，提取溫度為70℃，提取時(shí)間1.5 h.

3 討論

采用上述提取工藝，馬比木根中喜樹(shù)堿的提取率可以達(dá)到0.16%，而據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，喜樹(shù)果實(shí)中喜樹(shù)堿的提取率為0.734‰[5]，喜樹(shù)葉中喜樹(shù)堿的提取率為0.114 2%[6]，由此可見(jiàn)馬比木根中喜樹(shù)堿的提取率較高，可做為喜樹(shù)堿的藥源植物進(jìn)行進(jìn)一步的研究和開(kāi)發(fā)利用.

該工藝以甲醇為提取溶劑，提取時(shí)間短，能量消耗低，在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中溶劑便于回收利用，降低了經(jīng)濟(jì)成本，減少環(huán)境污染.所以，以馬比木為原料，利用此工藝條件提取喜樹(shù)堿，可以產(chǎn)生很好的經(jīng)濟(jì)效益.

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