鐘存貴，余愛農(nóng)

(湖北民族學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,湖北 恩施 445000)

美拉德反應(yīng)是指氨基化合物(如胺、氨基酸、低級肽、蛋白質(zhì)等)與羰基化合物(如還原糖、脂質(zhì)以及由此而來的醛、酮、多酚、抗壞血酸、膽固醇等)之間經(jīng)縮合、聚合而生成類黑精的反應(yīng).它使食品顏色加深并賦予食品一定的風(fēng)味[1]，所以在工業(yè)上常用于人造香精，尤其是肉香味.長期以來，美拉德熱反應(yīng)香精的研究多集中在糖類和氨基酸(尤其是半胱氨酸)上，基于更高一級的肽類美拉德反應(yīng)研究較少.

谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸結(jié)合而成的三肽，半胱氨酸上的巰基為其活性基團(tuán).還原型谷胱甘肽(GSH)廣泛存在于自然界中，動物肝臟、酵母和植物胚芽中都有豐富的GSH.在食品加工工業(yè)中GSH也有著廣泛的應(yīng)用.發(fā)達(dá)國家如日本等國不僅將谷胱甘肽作為生物活性添加劑，而且積極開發(fā)其為保健食品.而抗壞血酸(ASA)普遍存在于植物性食品如蔬菜、水果中以及動物性食品如牛乳和肝中.研究GSH和ASA的美拉德反應(yīng)有助于對實際食品體系生產(chǎn)中美拉德反應(yīng)進(jìn)行合理的控制和利用， 為優(yōu)化加工工藝提供理論參考和技術(shù)支持.再加上ASA普遍存在及價格低廉，以及人們對熱反應(yīng)香料香精安全性的認(rèn)可，以ASA與GSH作為前體物來制備肉味香料香精在當(dāng)前越來越具有現(xiàn)實意義.

尿素(Urea)廣泛存在于各類動物的肌肉組織中，作為精氨酸降解的中間產(chǎn)物或者通過酵母和細(xì)菌脫氫的產(chǎn)物，它也微量存在于多種發(fā)酵食品和飲料中，它在食品中的存在會嚴(yán)重降低食品品質(zhì).Pastoriza等人[2]在對食品進(jìn)行熱處理的過程中，通過消減肉品中尿素的含量從而顯著地改善了食品的香氣特征.可見在食品加工過程中，尿素對香味化合物的形成是有影響的.在菜品烹制過程中， 尤其是將富含 ASA 的食材與肉品共同烹制時，肉品中較高濃度的尿素也很可能對所烹制菜品的香味產(chǎn)生影響.因此，本文基于ASA與GSH的模式反應(yīng)，研究了尿素對模式反應(yīng)形成香味化合物的影響，為研制新型高象真性香料香精積累相關(guān)數(shù)據(jù)，并為深入研究抗壞血酸在Maillard反應(yīng)中的作用機(jī)理提供參考.

圖1 ASA與GSH在pH8和(141±2)℃反應(yīng)2 h生成香味化合物的總離子圖

1 實驗部分

1.1 材料

L-GSH(>98%,上海源聚生物科技有限公司);ASA(分析純,上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；尿素(AR，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);C5-C22正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購自Pure Chemical Analysis Co .Ltd.;十二水合磷酸氫二鈉(分析純,上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；NaOH(分析純，天津福晨化學(xué)試劑廠).

1.2 實驗方法

準(zhǔn)確稱取0.307 3 g(1.0 mmol)GSH、0.176 1 g(1.0 mmol)ASA分別溶于10 mL(0.2 mol·L-1)Na2HPO4溶液,在PHSJ-4A型pH計(上海金鵬分析儀器有限公司,中國)監(jiān)控下用固體NaOH調(diào)溶液pH值為8.00，加入1.0 mmol的尿素，倒入P170005厚壁耐壓反應(yīng)瓶(北京欣維爾玻璃儀器有限公司,中國)中密封,在(141±2) ℃油浴中加熱攪拌反應(yīng)2 h,然后用冷水沖淋快速冷卻反應(yīng)瓶,置于4℃ 冰箱中保存.同時制備不添加尿素的空白樣品.所有制備樣平行制備2份.

取7 mL反應(yīng)液置于15 mL專用萃取瓶,放入SPME裝置中,在40℃下平衡15 min,然后采用CAR/PDMS(75 μm thickness)萃取頭，頂空固相微萃取50 min,隨之進(jìn)行GC-MS分析.C5-C22正構(gòu)烷烴在相同條件下被分析,以計算被檢測化合物的線性保留指數(shù)(LRI).未知化合物經(jīng)計算機(jī)檢索同時與最新標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫NIST08譜庫和Wiley275譜庫相匹配，對正反匹配度均大于800(最大值為1 000)的結(jié)果進(jìn)一步采用線性保留指數(shù)(LRI)定性.被分離組分的TIC-Peak峰面積使用Agilent GC-MS工作站在設(shè)定積分閾值為17.0時積分獲得[3].每個樣品均設(shè)定兩次重復(fù)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差<25%則視為有效.

1.3 實驗條件

1.3.1 色譜條件 色譜柱：DB-5 毛細(xì)柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序：40℃等溫保持5 min，然后5℃/min升至260℃，再15℃/min升至280℃，保持1 min；載氣(He)流速0.9 mL/min；進(jìn)樣口溫度250℃；分流模式進(jìn)樣，分流比5∶1.

1.3.2 質(zhì)譜條件 電子轟擊(EI)離子源；電子能量70 eV；接口溫度280℃；離子源溫度230℃；四級桿溫度150℃；電子倍增電壓1 753 V；質(zhì)量掃描范圍m/z 30～400.

2 結(jié)果與討論

ASA與GSH反應(yīng)生成香味化合物的總離子圖如圖1和圖2所示.

反應(yīng)液具有肉香和硫磺樣氣味，通過對實驗揮發(fā)性成分的分析鑒定，共發(fā)現(xiàn)了39種香味化合物，如表1所示.可分為含氧雜環(huán)呋喃類、含氮雜環(huán)的吡嗪類、含硫芳香化合物等類別.

呋喃類只有一種為2-甲基呋喃(1).含量較少，占總香味化合物量的比例不到5%.它是抗壞血酸熱降解產(chǎn)生的[6].它在添加尿素后有所下降，但降幅不大，從6.90×107峰面積計數(shù)降到5.47×107峰面積計數(shù).

圖2 ASA、GSH與Urea在pH8和(141±2)℃反應(yīng)2 h生成香味化合物的總離子圖

吡嗪類共三種化合物，包括甲基吡嗪(7)、2-6-二甲基吡嗪(13)、6-甲基-2-乙基吡嗪(18).吡嗪類占總香味化合物的量不到3%，含量很少.其中甲基吡嗪被視為產(chǎn)生肉香的主要成分.吡嗪類添加尿素后增幅最大，從1.80×107峰面積計數(shù)到9.39×107峰面積計數(shù).這說明尿素的加入對吡嗪類香味化合物的產(chǎn)量有顯著的影響.

含硫芳香化合物種類較多包括噻吩類、噻唑類、硫醇類、噻吩并噻吩類和脂環(huán)多硫化物.它們是此模式反應(yīng)的主要香味成分.Lu[4]用谷胱甘肽與葡萄糖在160℃下反應(yīng)1 h，主要揮發(fā)性產(chǎn)物是含硫揮發(fā)物，如噻吩，噻唑類和脂環(huán)硫化物等.這與本實驗基本一致.含硫芳香化合物擁有低嗅覺閾值，特征氣味，對不同食物的肉香味有顯著貢獻(xiàn).

模式反應(yīng)噻吩類種類最多達(dá)到18種.大多數(shù)噻吩都具有特定的香味，如3-甲基-2-乙?；绶?26)通常具有蜂蜜般的甜香[5]，它們通常是由糠醛與H2S作用形成，或者由巰基乙醛與不飽和醛縮聚而成[6].2,5-二甲基-3-乙?；绶?32)的香味能改善煙草制品的氣味[5].噻吩的總量變化不大，由未添加尿素時的5.364×108峰面積計數(shù)減少至添加尿素后的5.274×108峰面積計數(shù).

脂環(huán)硫化物是重要的產(chǎn)生肉香風(fēng)味的一類香味分子[7],模式反應(yīng)共生成了6種脂環(huán)硫化物，包括3，5-二甲基-1，2，4-三硫環(huán)戊烷(24，25)、4，6-二甲基-[1,2,3]三硫環(huán)戊烷(30，31)、3，5-二乙基-1，2，4-三硫環(huán)戊烷(35)和1,2,5,6-四硫環(huán)辛烷(37).其中的順反3，5-二甲基-1，2，4-三硫環(huán)戊烷是典型的肉香化合物.它具有肉的特征香味，在低濃度時具有清燉牛肉的香味，高濃度時具有洋蔥和硫磺樣氣味.一般認(rèn)為，脂環(huán)硫化物主要由乙醛、 巰基乙醛和H2S縮聚而成[8].在添加尿素后幾乎所有脂環(huán)硫化物的產(chǎn)量都顯著降低，總量由未添加尿素時的3.716×108峰面積計數(shù)減少至添加尿素后的2.202×108峰面積計數(shù).

噻唑也是重要的香味化合物，有研究表明[9]，噻唑可能是由一個二羰基化合物或羥基酮、H2S、NH3和一個醛反應(yīng)形成，它們對反應(yīng)產(chǎn)物肉香味的形成也有較大貢獻(xiàn).噻唑類總量稍有下降由未添加尿素時的1.10×108峰面積計數(shù)減少至添加尿素后的 0.903×108峰面積計數(shù).

模式反應(yīng)中形成了兩種硫醇：2-噻吩硫醇(15)和4-甲基-1，2-苯二硫醇(36)，這可能是由于硫化氫和二羰基或呋喃酮相互作用形成[10].它們的總量在加入尿素后變化不大.

此外產(chǎn)物中還發(fā)現(xiàn)了三種噻吩并噻吩化合物：噻吩[3,2-b]并噻吩(27)、2-甲基噻吩[2,3-b]并噻吩(34)和2-乙基噻吩[2,3-b]并噻吩(38)，其中前兩種生成量較大.噻吩[3,2-b]并噻吩(29)在其他美拉德反應(yīng)中也有發(fā)現(xiàn)[11]，并已有人工合成.它們的總量在加入尿素后稍有提高，由未添加尿素時的0.909×108峰面積計數(shù)增加至添加尿素后的 1.093×108峰面積計數(shù).

表1 抗壞血酸和谷胱甘肽美拉德反應(yīng)形成的香味化合物

續(xù)表1

N: not detected*表示化合物的順反異構(gòu)體cis or trans isomer LRI:線性保留指數(shù)

綜上所述，尿素的加入影響明顯的是吡嗪和脂環(huán)硫化物的生成量.一般認(rèn)為，吡嗪的形成產(chǎn)量與NH3的大量存在聯(lián)系緊密[12].根據(jù)文獻(xiàn)[13]，單獨的尿素( 0.10 mol/L) 在140℃密閉條件下熱分解實驗表明，在高溫密閉體系中，尿素能夠分解產(chǎn)生NH3.而GSH加熱分解產(chǎn)生H2S，而H2S在加熱時對生成不同含硫揮發(fā)物起了重要作用[14].Zheng等[15]報道了H2S在加熱反應(yīng)中參與了生成含硫芳香化合物，它是不同肉味芳香物如硫醇、噻吩、噻唑和多硫化合物的前體物.硫化氫與抗壞血酸降解產(chǎn)物經(jīng)過一系列中間反應(yīng)得到各種噻吩類、吡嗪類、硫醇類、噻吩并噻吩類.

因而，在模式體系中加入尿素將會導(dǎo)致反應(yīng)體系中NH3的增加，NH3和H2S與ASA降解中間體發(fā)生競爭反應(yīng)，結(jié)果較大地降低了脂環(huán)硫化物的產(chǎn)量，促進(jìn)了吡嗪的生成，使模式反應(yīng)終產(chǎn)物的總體香味特征由肉香味向兼有烤香、堅果香味的肉香轉(zhuǎn)變.這說明，通過改變模式體系中尿素的濃度，可以實現(xiàn)對ASA-GSH模式反應(yīng)產(chǎn)物總體香味特征的調(diào)節(jié).

3 結(jié)論

尿素的加入較大的影響了ASA和GSH的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中吡嗪和脂環(huán)硫化物的產(chǎn)量.GSH加熱分解產(chǎn)生H2S，尿素分解產(chǎn)生NH3.NH3和H2S 與ASA降解中間體發(fā)生競爭反應(yīng)，結(jié)果較大地降低了脂環(huán)硫化物的產(chǎn)量，促進(jìn)了吡嗪的生成.通過改變模式體系中尿素的濃度，可以實現(xiàn)對ASA-GSH模式反應(yīng)產(chǎn)物總體香味特征的調(diào)節(jié).

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