陳昭喆，宋亞輝，謝秀樂(lè)，蔡倫安，孫向東

(河南省信陽(yáng)市中心醫(yī)院心內(nèi)科 464000)

Th17細(xì)胞是一種新近發(fā)現(xiàn)的介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的效應(yīng)CD4+輔助性T細(xì)胞亞型，白介素-17(IL-17)是其最重要和標(biāo)志性的細(xì)胞因子。IL-17家族在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)、穩(wěn)定組織器官的內(nèi)環(huán)境及自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵的作用[1]。近來(lái)的研究表明IL-17在心肌炎等多種心血管疾病中表達(dá)增加，在心血管病慢性炎癥性過(guò)程起到了一定作用。心肌梗死(MI)后的炎癥反應(yīng)是心室重塑發(fā)生的機(jī)制之一，本文旨在研究IL-17在MI大鼠心肌中的表達(dá)及其在MI后心室重塑中的作用。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物模型的分組及制備 選用體質(zhì)量(200±20)g的Sprague-Dawley雄性大鼠110只(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(鄂)2010-0009。于2010年5～12月在湖北省生物靶向治療研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，本研究遵循國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例及國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理實(shí)施細(xì)則。稱量大鼠體質(zhì)量后用10%水合氯醛(40 mg/kg)腹腔注射麻醉。同時(shí)連接心電圖機(jī),用肢體導(dǎo)聯(lián)進(jìn)行心電圖監(jiān)測(cè)。氣管切開(kāi)后插入靜脈輸液套管針,連接奧爾科特生物公司ALC-V8型小動(dòng)物呼吸機(jī)，潮氣量2～3 mL/100 g,吸呼比1∶3,呼吸頻率60 次/分鐘。經(jīng)左前胸第3、4 肋間開(kāi)胸,充分暴露心臟,剝除心包。用已浸入液氮內(nèi)預(yù)冷5 min的銅質(zhì)金屬棒(直徑5 mm，溫度：-197 ℃)充分接觸左室游離壁15 s，同一部位反復(fù)冷凍4～5次，制成MI模型。液氮冷凍范圍內(nèi)的心肌明顯腫脹、變暗、室壁運(yùn)動(dòng)減弱，心電監(jiān)護(hù)示ST段抬高至少0.5 mV，且30 min內(nèi)不回落，表明MI模型制備成功，縫合胸腔。術(shù)后腹腔內(nèi)注射青霉素鈉2×105U/d,連續(xù)3 d。造模成功72只，造模成功率為65.45%，將大鼠隨機(jī)分為MI對(duì)照組(C組)、小鼠同型IgG組(G組)和IL-17抗體組(A組)。每組又隨機(jī)分為2個(gè)亞組：4周組及8周組，C組至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)分別有10只、9只進(jìn)入結(jié)果分析，G組至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)分別有9只、8只進(jìn)入結(jié)果分析，A組至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)分別有10只、8只進(jìn)入結(jié)果分析。另設(shè)假手術(shù)組8只(S組)，大鼠進(jìn)行以上同樣的手術(shù)過(guò)程,但不冷凍左室游離壁心肌(實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)為術(shù)后第56天,至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)仍有8只進(jìn)入結(jié)果分析)。全部共54只。MI大鼠各組共死亡18只，其中8只死于心力衰竭，5只死于感染，3只死于心律失常，2只死于出血，S組無(wú)脫失或死亡。手術(shù)后第1天開(kāi)始，根據(jù)文獻(xiàn)[2]S組和C組分別腹腔注射磷酸鹽緩沖液(PBS)(0.8 mL PBS溶液，并注入0.2 mL空氣促使液體分散到腹腔內(nèi))，G組、A組分別注射小鼠同型IgG1+PBS溶液(100 μg IgG1溶于0.8 mL PBS，同樣注入0.2 mL空氣)(美國(guó)R&D公司)、小鼠抗人IL-17單克隆抗體+PBS溶液(100 μg IL-17抗體溶于0.8 mL PBS溶液，同樣注入0.2 mL空氣)(美國(guó)R&D公司)。每隔1天用藥1次，連續(xù)用藥5次。在到達(dá)各時(shí)間點(diǎn)后,處死各組大鼠,取出心臟標(biāo)本，置于-80 ℃冰箱凍存。

1.2免疫組織化學(xué)方法測(cè)定心?、?Ⅲ膠原比例 石蠟切片采用鏈霉卵白素-生物素-辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物法(SP法)，常規(guī)脫蠟至水,3%H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，微波抗原修復(fù)后,10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉,滴加50倍稀釋的一抗,37 ℃孵育1 h,PBS沖洗,5 min×3次。滴加生物素標(biāo)記的二抗;37 ℃孵育15 min;PBS沖洗,5 min×3次，滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液;滴加DAB顯色，中性樹(shù)膠封片，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，測(cè)定非梗死區(qū)Ⅰ、Ⅲ型膠原染色陽(yáng)性(心肌細(xì)胞間隙及血管周圍棕色條紋)區(qū)域面積,每個(gè)心臟標(biāo)本隨機(jī)取8個(gè)高倍視野(×200)，膠原含量計(jì)為膠原占整個(gè)高倍視野中心肌面積的百分率，取其平均值，計(jì)算Ⅰ/Ⅲ膠原比例。

1.3Western blot檢測(cè)各組心肌組織IL-17蛋白質(zhì)表達(dá) 取左心室游離壁心肌組織(50～100 mg)，勻漿后，PBS洗3次，加入適量組織蛋白裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，吸取上清液，按照BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明進(jìn)行蛋白定量測(cè)定。在電泳儀上用等量蛋白質(zhì)樣品經(jīng)15% SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移于硝酸纖維素膜(PVDF)膜上。1∶1 000的兔抗大鼠IL-17多克隆一抗4 ℃(美國(guó)Abcam公司，ab79056)靜置孵育過(guò)夜，PBS洗滌3次，再以1∶10 000過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(武漢飛羿公司)室溫孵育2 h，PBS充分洗滌后，在暗室用ECL試劑盒(美國(guó) PIERCE公司)發(fā)光顯影，X光膠片壓片曝光，同時(shí)檢測(cè)GAPDH(武漢飛羿公司)的表達(dá)作為內(nèi)參對(duì)照。圖片經(jīng)光密度圖像掃描儀(HP)掃描,使用Qantity One程序?qū)l帶進(jìn)行灰度測(cè)定。以S組條帶灰度值為100%，其他各組條帶灰度值與S組條帶灰度值的比值，即為其相對(duì)表達(dá)量(%)。

1.4超聲心動(dòng)圖相關(guān)指標(biāo) 各組大鼠在手術(shù)4、8周后進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查。大鼠麻醉后固定,應(yīng)用美國(guó)GE公司Vivid7型彩色超聲診斷儀,經(jīng)胸壁高頻超聲10 S探頭,頻率11.4 MHz,圖像深度2.0 cm。鼠臺(tái)向左傾斜30°，將探頭放置于胸骨左側(cè)，選取標(biāo)準(zhǔn)左室乳頭肌短軸切面和長(zhǎng)軸切面在二維影像指導(dǎo)下采用M型超聲測(cè)量以下指標(biāo)：左室舒張期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD)、左室收縮內(nèi)徑(left ventricular end-systole dimension，LVESD)、左室短軸縮短率(left ventricular fractional shorting，LVFS)、左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)、舒張末期容積(end-diastolic volume，EDV)、收縮末期容積(end-systole volume，ESV)。每一測(cè)定值均取3個(gè)連續(xù)完整心動(dòng)周期測(cè)量的平均值。

2 結(jié) 果

2.1免疫組化檢測(cè)Ⅰ/Ⅲ膠原比例 與S組相比，MI各組大鼠心肌組織在4、8周時(shí)的Ⅰ/Ⅲ膠原比例均明顯高于S組(P<0.05)；與C組和G組相比，A組在4、8周的Ⅰ/Ⅲ膠原比例明顯改善(P<0.05)；而G組與C組相比無(wú)明顯變化(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組Ⅰ/Ⅲ膠原比例

2.2Western blot檢測(cè)各組大鼠心肌IL-17的表達(dá) 與S組相比，MI各組大鼠心肌組織在4、8周時(shí)的IL-17表達(dá)水平均明顯高于S組；與C組和G組相比，A組在4、8周的IL-17表達(dá)水平明顯低于兩組(P<0.05)；而G組與C組相比無(wú)明顯變化(P>0.05)。見(jiàn)圖1。

★：P<0.05，與S組比較；※：P<0.05，A組與C組比較。

2.3超聲心動(dòng)圖結(jié)果 超聲心動(dòng)圖結(jié)果顯示大鼠左心室結(jié)構(gòu)和功能呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，C組、G組、A組大鼠LVEDD、LVESD、EDV、ESV較S組均逐漸升高；LVEF、LVFS較S組均有所降低(P<0.05)，以8周最明顯，提示8周后構(gòu)建大鼠MI模型成功，而S組各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)明顯變化。與C組相比，A組大鼠LVEDD、LVESD、LVEDV、LVESV降低，而LVEF、LVFS升高，心功能各項(xiàng)指標(biāo)均有改善(P<0.05)，而G組與C組相比則未見(jiàn)明顯改善(P>0.05)。8周的變化趨勢(shì)較4周更顯著。見(jiàn)圖2、表1。

表2 各組大鼠超聲心動(dòng)圖檢查結(jié)果比較±s)

A：S組；B：C組；C：G組；D：A組。

3 討 論

IL-17是Th17細(xì)胞來(lái)源的強(qiáng)力炎癥前細(xì)胞因子，可調(diào)節(jié)前炎性因子、趨化因子等的產(chǎn)生及分泌，在多種自身免疫介導(dǎo)的組織損傷及炎癥過(guò)程中十分關(guān)鍵。IL-17主要是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞釋放前炎癥因子及動(dòng)員中性粒細(xì)胞的細(xì)胞因子而發(fā)揮作用，而近來(lái)的一些研究證明,IL-17在多種心血管疾病中如：自身免疫性心肌炎、病毒性心肌炎、擴(kuò)張型心肌病、不穩(wěn)定的冠心病等表達(dá)增加,可能在心血管病慢性炎癥性過(guò)程起到了一定作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，與S組相比，C組、G組和IL-17抗體組4周、8周組大鼠心肌組織中IL-17的表達(dá)均明顯升高(P<0.05)，同時(shí)超聲心動(dòng)圖相關(guān)參數(shù)明顯惡化(P<0.05)；Ⅰ/Ⅲ膠原比例均明顯高于S組(P<0.05)；而MI大鼠經(jīng)抗體干預(yù)處理后,心肌組織IL-17表達(dá)顯著減少(P<0.05),A組在4周、8周的Ⅰ/Ⅲ膠原比例及超聲心動(dòng)圖相關(guān)參數(shù)明顯改善(P<0.05)，以上結(jié)果提示在MI發(fā)生、發(fā)展中，心室重塑的發(fā)生可能與心肌組織IL-17表達(dá)有關(guān)。MI的過(guò)程是炎癥反應(yīng)的過(guò)程，免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)則起到加重心肌損傷和擴(kuò)大MI范圍的作用。壞死的心肌組織引起補(bǔ)體的激活、細(xì)胞因子的釋放、炎癥和免疫細(xì)胞的趨化和浸潤(rùn)，同時(shí)也通過(guò)病理性自身免疫應(yīng)答參與了心肌損傷。研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，炎癥性細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、IL-17等，在不同大鼠動(dòng)物模型的血清或組織中水平較正常健康狀態(tài)都有所升高。MI后會(huì)伴隨有一系列細(xì)胞因子和黏附分子的表達(dá)，TNF-α、IL-1、lL-6和趨化性細(xì)胞因子是啟動(dòng)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子，又被稱為前炎癥細(xì)胞因子，前炎癥細(xì)胞因子與MI后心室重塑的發(fā)展有密切關(guān)系。在MI后梗死區(qū)和非梗死區(qū)都有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞因子參與的炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是心室重塑形成的必備條件，心室重塑過(guò)程伴有神經(jīng)-體液和炎癥性細(xì)胞因子的激活，同時(shí)這些因素的激活又促進(jìn)心室重塑的發(fā)展。

Dolores等[5]認(rèn)為,IL-17可能通過(guò)自分泌和旁分泌機(jī)制影響成纖維細(xì)胞的生物學(xué)活性,非免疫性細(xì)胞如小鼠心肌成纖維細(xì)胞存在低水平的IL-17基礎(chǔ)分泌,IL-17通過(guò)IL-17 RA和IL-17 RC依賴方式刺激成纖維細(xì)胞的膠原的產(chǎn)生，心臟成纖維細(xì)胞通過(guò)刺激產(chǎn)生膠原和其他細(xì)胞外基質(zhì)在心室重塑和纖維化中起一定作用。Feng等[2]研究發(fā)現(xiàn)IL-17通過(guò)OPG/RANK/RANKL和MMP/TIMP系統(tǒng)參與自身免疫性心臟疾病和非自身免疫性心臟疾病引起的心力衰竭心臟重塑的病理過(guò)程，可能是各種心力衰竭心臟重塑的共同致病因子。Liu等[6]研究發(fā)現(xiàn),IL-17能顯著增加心肌成纖維細(xì)胞MMP-2和MMP-9的表達(dá)和中等程度降低TIMP-1、TIMP-2的表達(dá),給予抗IL-17抗體后,心肌成纖維細(xì)胞MMP-2和MMP-9的表達(dá)顯著減少,而TIMP-1和TIMP-2的表達(dá)則升高。Kaliyamurthi等[7]研究發(fā)現(xiàn)人心肌成纖維細(xì)胞表達(dá)低水平的MMP-1 mRNA、IL-17呈時(shí)間、劑量依賴性誘導(dǎo)的表達(dá),由IL-17誘導(dǎo)的MMP-1 mRNA表達(dá)的作用能被IL-17或IL-17R中和抗體所阻滯。而且除MMP-1外,IL-17尚可誘導(dǎo)MMP-2、3、9和13的表達(dá),后者在心肌重塑中起重要作用。因此，IL-17有可能是通過(guò)增加各種MMPs包括MMP-1的表達(dá)在DCM中起一定作用，抑制IL-17的表達(dá)可能會(huì)降低心肌炎癥和損傷后的纖維化和重塑。近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),IL-17同IL-1、TNF-α有協(xié)同作用[8]，可以放大加強(qiáng)其致炎效應(yīng)[9-10]，這可能是IL-17導(dǎo)致MI后心室重塑的另一機(jī)制。聯(lián)合運(yùn)用IL-17和TNF-α抑制劑能夠更好地控制炎癥及增強(qiáng)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能。本實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)IL-17在8周和4周的變化趨勢(shì)與超聲心動(dòng)圖相關(guān)參數(shù)的變化趨勢(shì)不盡相符，說(shuō)明心室重塑除了IL-17自身作用外尚有其他的機(jī)制比如TNF-α等其它細(xì)胞因子的作用因素。

綜上所述，MI后心肌組織大量表達(dá)IL-17可能與MI后心室重塑的發(fā)生有關(guān)，抗IL-17治療可能成為心臟重塑治療的潛在策略和新的靶點(diǎn)，進(jìn)一步研究IL-17的作用可能會(huì)發(fā)現(xiàn)心室重塑新的發(fā)生機(jī)制，從而為MI后心室重塑的預(yù)防和治療帶來(lái)新的視角和方法。

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