姚廣裕，何 萍，楊名添，劉民鋒，葉長(zhǎng)生△

(1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院乳腺中心，廣州 510515；2.廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科，廣州510120；3.中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺科，廣州 510515)

盡管淋巴道轉(zhuǎn)移是乳腺癌最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移途徑之一，但是，淋巴道轉(zhuǎn)移的機(jī)制目前還未完全清楚。近來(lái)，腫瘤新生淋巴管的發(fā)現(xiàn)使人們對(duì)乳腺癌淋巴道轉(zhuǎn)移的機(jī)制有了新的認(rèn)識(shí)——腫瘤的新生淋巴管在腫瘤的淋巴道轉(zhuǎn)移中可能起著主導(dǎo)的作用[1]?，F(xiàn)在研究認(rèn)為，乳腺癌組織內(nèi)新的淋巴管主要是腫瘤細(xì)胞分泌的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C(vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C)誘導(dǎo)形成的[2]。但由于缺乏淋巴管特異性標(biāo)記物，對(duì)腫瘤淋巴管的研究相對(duì)緩慢。單克隆抗體D2-40是新近發(fā)現(xiàn)的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物，可以用于觀察乳腺癌的新生淋巴管[3]。另外，Boardman和Swartz[4]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在淋巴管形成過(guò)程中，淋巴管將要延伸的下游位置膠原發(fā)生降解，他認(rèn)為膠原溶解的主要酶類(lèi)是基質(zhì)金屬蛋白酶。本文擬通過(guò)分析基質(zhì)金屬蛋白酶中最重要的成員之一——膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1(membrane type-1 MMP,MT1-MMP)與VEGF-C、淋巴管密度的關(guān)系，提供MT1-MMP參與乳腺癌淋巴管生成的證據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院2009年10月至2011年1月收治的乳腺癌患者87例。所有患者均為女性，中位年齡47歲。根據(jù)患者臨床狀況行乳腺癌改良根治術(shù)、乳腺癌保留乳房手術(shù)，均有完整的術(shù)后病理資料。

1.2方法 免疫組化所用的MT1-MMP和VEGF-C一抗為NeoMarkers公司的兔抗人單克隆抗體，D2-40一抗為杭州華安生物技術(shù)有限公司即用型鼠抗人單克隆抗體，二抗試劑盒為福建邁新公司的SP超敏試劑盒。

所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，行病理常規(guī)染色檢查及免疫組化研究。免疫組化染色采用SP法，抗原經(jīng)高壓修復(fù)，實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果判斷：MT1-MMP免疫組化陽(yáng)性染色為棕黃色顆粒，位于腫瘤細(xì)胞胞膜；VEGF-C陽(yáng)性顆粒呈棕黃色，位于腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分，定義陽(yáng)性細(xì)胞大于10%者為陽(yáng)性病例，陽(yáng)性細(xì)胞小于10%者為陰性病例。

標(biāo)記微淋巴管密度(LMVD)判定采用Choi等[5]報(bào)道的方法：D2-40染色呈陽(yáng)性染色的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇分別計(jì)為一個(gè)陽(yáng)性微淋巴管，管腔大于8個(gè)紅細(xì)胞直徑或有血管平滑肌的管狀結(jié)構(gòu)不計(jì)入內(nèi)。乳腺癌組織先在低倍鏡(×40)視野下分別選取腫瘤邊緣和腫瘤中心區(qū)中脈管最豐富的兩個(gè)區(qū)域即“熱點(diǎn)”，再在高倍鏡(×400)下分別計(jì)數(shù)微淋巴管數(shù)目，每例計(jì)數(shù)3個(gè)視野，取其均值作為L(zhǎng)MVD。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，計(jì)數(shù)資料分析采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料分析采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1MT1-MMP、VEGF-C、D2-40在乳腺癌組織中的表達(dá) 采用免疫組化方法檢測(cè)乳腺癌組織中MT1-MMP蛋白的表達(dá)，其陽(yáng)性率為56.3%，陽(yáng)性染色定位于腫瘤細(xì)胞(封2圖1)。VEGF-C陽(yáng)性率為67.8%，顆粒呈棕黃色，位于腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)(封2圖2)。87例乳腺癌組織中均可看到不同程度的D2-40陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性染色定位于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)和(或)胞漿并呈棕黃色顆粒(封2圖3)。

2.2MT1-MMP、VEGF-C、LMVD與乳腺癌腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 MT1-MMP陰性的患者，腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為59.5%，而MT1-MMP陽(yáng)性的患者腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為82.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.025)，二者的相關(guān)系數(shù)為0.3(P=0.005)。VEGF-C陰性的患者，腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為46.4%，而VEGF-C陽(yáng)性的患者腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為84.7%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)，二者的相關(guān)系數(shù)為0.394(P=0.000)。而且由表1也可以看出，隨著腋窩淋巴結(jié)數(shù)目轉(zhuǎn)移增多，腫瘤的淋巴管密度也明顯增加(P=0.000)。

表1 MT1-MMP、VEGF-C、LMVD與乳腺癌腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

2.3MT1-MMP與VEGF-C、LMVD的關(guān)系 免疫組化結(jié)果顯示，MT1-MMP陽(yáng)性的患者中VEGF-C的陽(yáng)性率為86.0%，而MT1-MMP陰性的患者中VEGF-C的陽(yáng)性率為43.2%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，二者的相關(guān)系數(shù)為0.452(P=0.000)。MT1-MMP陽(yáng)性的患者中LMVD的平均值為30.2個(gè)，而MT1-MMP陰性的患者中LMVD的平均值為25.1個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，二者的相關(guān)系數(shù)為0.368(P=0.000)，見(jiàn)表2。

表2 MT1-MMP與VEGF-C、D2-40的關(guān)系

3 討 論

基礎(chǔ)和臨床研究都表明，腫瘤新生淋巴管是促進(jìn)乳腺癌癌細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移的主要因素[6-7]。目前研究表明，腫瘤促使淋巴管新生是腫瘤細(xì)胞分泌的生長(zhǎng)因子調(diào)控的，主要是VEGF-C。VEGF-C與淋巴上皮細(xì)胞表面的受體VEGFR3結(jié)合后，通過(guò)酪氨酸激酶信號(hào)系統(tǒng)發(fā)揮作用，促進(jìn)淋巴管上皮的增生、遷移和新的淋巴管形成[8-9]。目前，很多研究都顯示無(wú)論是乳腺癌、肺癌、甲狀腺癌還是胃癌、食道癌和大腸癌，腫瘤內(nèi)新生淋巴管標(biāo)記物的表達(dá)都與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[6-7，10-13]。本研究也提示，乳腺癌中腫瘤細(xì)胞VEGF-C的表達(dá)與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。

然而，VEGF-C的作用是使腫瘤周?chē)呀?jīng)存在的淋巴管上皮增生、出芽、形成管狀結(jié)構(gòu)。但是，新生的淋巴管如何同周?chē)|(zhì)構(gòu)建成新的組織，并最終使新生淋巴管成為腫瘤內(nèi)間質(zhì)的組成部分呢？這就涉及基質(zhì)的降解和重建，目前在新生淋巴管的研究中，對(duì)于基質(zhì)的變化關(guān)注尚不多見(jiàn)。

基質(zhì)降解和重建首先是一個(gè)基質(zhì)組分的酶解過(guò)程，參與這一過(guò)程的主要酶類(lèi)是基質(zhì)金屬蛋白酶家族(matrix metalloproteinases，MMPs)，其中MT1-MMP在腫瘤基質(zhì)代謝中的作用最受關(guān)注。MT1-MMP通過(guò)跨膜結(jié)構(gòu)域固定于細(xì)胞膜表面發(fā)揮作用，不僅可以直接降解諸如膠原、纖維結(jié)合蛋白等基質(zhì)組分，而且可以激活MMP-2降解多種基質(zhì)成分。在實(shí)驗(yàn)中還證實(shí)，MT1-MMP降解基質(zhì)主要是通過(guò)后一種機(jī)制[14]。

那么，MT1-MMP是否參與乳腺癌淋巴管新生過(guò)程呢？本研究從免疫組化的層面分析了這一關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，免疫組化結(jié)果顯示，MT1-MMP陽(yáng)性的患者中VEGF-C的陽(yáng)性率明顯高于MT1-MMP陰性的患者(86.0%vs43.2%，P=0.000)。MT1-MMP陽(yáng)性的患者中LMVD的平均值明顯高于MT1-MMP陰性的患者(30.2個(gè)vs25.1個(gè)，P=0.000)。這一結(jié)果說(shuō)明，在LMVD高的腫瘤中，即在新生淋巴管活躍的腫瘤中，不僅VEGF-C表達(dá)高，而且MT1-MMP表達(dá)也高。這就提示，MT1-MMP參與了新生淋巴管的生成過(guò)程。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于MT1-MMP是否參與乳腺癌淋巴管新生過(guò)程僅在Nisato等[15]的研究中稍有暗示，他們?cè)隗w外淋巴上皮三維培養(yǎng)過(guò)程中，可以檢測(cè)到MT1-MMP mRNA的表達(dá)增加。但是，Nisato等[15]研究并非設(shè)計(jì)研究MT1-MMP與乳腺癌新生淋巴管的關(guān)系，因此，尚不足以回答MT1-MMP是否參與新生淋巴管的生成過(guò)程這個(gè)問(wèn)題。但是，可以推測(cè)，在惡性腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞可以同時(shí)促進(jìn)VEGF-C和MT1-MMP的表達(dá)，此時(shí)VEGF-C可以促進(jìn)淋巴管上皮的增生、遷移，而MT1-MMP則通過(guò)降解腫瘤周?chē)拈g質(zhì)，為新的淋巴管延伸清除基質(zhì)屏障，從而共同促進(jìn)新生淋巴管形成，促使腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

惡性腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程。本研究從免疫組化著手，初步探討MT1-MMP與淋巴管生成的關(guān)系。今后的研究應(yīng)更加深入的研究MT1-MMP和VEGF-C的關(guān)系以及MT1-MMP參與腫瘤淋巴管生成的機(jī)制。

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