閻小青，董偉林

(1.天津市天津醫(yī)院，天津 300211; 2.天津醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，天津 300070)

HPLC法測定人血漿中奧沙普秦濃度*

閻小青1，董偉林2

(1.天津市天津醫(yī)院，天津 300211; 2.天津醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，天津 300070)

目的:建立固相萃取高效液相色法測定人血漿中奧沙普秦濃度的方法，并應用于人體血漿藥物濃度測定。方法:固相萃取凈化和富集血漿樣品。色譜柱為Kromasil C18柱，流動相為0.02 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(pH 5.0)－甲醇(85∶15)，流速為1.0 ml/min，紫外檢測波長285 nm。血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對樣品測定無干擾。結(jié)果:本方法奧沙普秦線性范圍為 0.1 ～100 μg/ml(r=0.999 2)，最低定量濃度為 0.1 μg/ml，回收率為99.39%，日內(nèi)、日間 RSD 均小于2%。結(jié)論:本法簡便、準確，適用于奧沙普秦臨床藥物濃度測定。

奧沙普秦，HPLC，血漿藥物濃度

奧沙普秦腸溶片 (oxaprozin enteric－coated tablets，商品名諾松)是臨床常用的丙酸類非甾體抗炎藥。具有抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱作用。其通過抑制環(huán)氧化酶，進而抑制前列腺素等的合成和釋放，起到鎮(zhèn)痛作用，療效肯定，副作用小，臨床用于風濕性關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、強直性脊椎炎、肩關節(jié)周圍炎及外傷和手術后消炎鎮(zhèn)痛等。本文在參考文獻［1－3］的基礎上，采用固相萃取凈化和富集血漿樣品HPLC法測定血漿中奧沙普秦濃度，本方法操作簡便、靈敏、快速，并已應用于口服奧沙普秦腸溶片的臨床藥物濃度測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 美國科美特高效液相色譜儀(包括:6000LDI精密恒流泵，6000PVW 紫外/可見檢測器，Rheodyne7725i型進樣閥，Anastar色譜工作站);Kromasil C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm，天津市琛航科學儀器有限公司);固相萃取小柱(C18/500 mg);BFX5－320型臺式離心機(河北省安新縣白洋離心機廠);MSB010.CX2.5型臺式高速離心機(SANYO);三環(huán)牌YKH－1型液體快速混合器(江西醫(yī)療器械廠);PB153－S型電子分析天平(瑞典梅特勒－托利多);C－9860A超聲波清洗器(天津市科貝爾光電技術有限責任公司);HGC－12A氮吹儀(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司);PHS－3C型精密pH計(上海精密科學儀器有限公司);Millipore－Q超純水裝置;20～200 μl微量加樣器(上海大龍醫(yī)療有限公司);100 μl微量進樣器(上海高鴿工貿(mào)有限公司)。

1.2 試藥 奧沙普秦對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號100353－200301);奧沙普秦腸溶片(湖北百科亨迪藥業(yè)有限公司，規(guī)格:200 mg/片，批號100203)。甲醇、乙腈為色譜純;磷酸二氫鉀等為分析純;水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Kromasil C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:0.02 mol/L 磷酸二氫鉀緩沖液(pH 5.0)甲醇(85∶15);流速:1.0 ml/min;紫外檢測波長:285 nm;進樣量:20 μl。

2.2 固相萃取條件 取血漿樣品200 μl，加入經(jīng)活化處理后的固相萃取小柱中，加入沖洗液(甲醇 －1 mmol/L鹽酸10∶90)1.0 ml，棄去沖洗液，加入甲醇2 ml沖洗固相萃取小柱，收集甲醇，吹干。殘留物加入200 μl流動相旋渦混合 3 min，16 000 r/min離心 5 min，取上清液 20 μl進樣分析。

2.3 對照品溶液的制備 精密稱取奧沙普秦對照品10 mg，置10 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成奧沙普秦濃度為1.0 mg/ml的儲備液。將該儲備液用甲醇稀釋成 0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0 和 100.0 μg/ml的系列溶液，備用。

2.4 血漿樣品處理 按照生物樣品采集和固相萃取條件操作，對血漿樣品血藥濃度進行測定。

2.5 方法專屬性 取空白血漿200 μl，按“2.2”項下方法操作，得色譜圖1－a;取空白血漿200 μl，加入50 μg/ml對照品溶液10 μl，按“2.2”項下自“加入固相萃取小柱”操作，得色譜圖1－b;取受試者用藥后的血漿樣品200 μl，按“2.2”項下作，得色譜圖 1 － c。結(jié)果表明，空白血漿中內(nèi)源物質(zhì)不干擾奧沙普秦的測定，奧沙普秦保留時間約為9.0 min。

圖1 空白血漿(A)空白血漿加入奧沙普秦(B)服藥2 h小時后血漿(C)HPLC色譜圖

2.6 標準曲線制備 取空白血漿200 μl，加入奧沙普秦對照品系列溶液適量，配制成奧沙普秦濃度為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0 和 100.0 μg/ml的含藥血漿樣品，自“加入固相萃取小柱”始，按“2.2”項下方法操作。以奧沙普秦濃度(X)為橫坐標，奧沙普秦的峰面積(Y)為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為:Y=4 039.4 X+14 907(r=0.999 2)。結(jié)果表明，血漿中奧沙普秦濃度在0.1～100 μg/ml范圍內(nèi)線性良好。血漿中奧沙普秦的最低定量濃度為0.1 μg/ml。

2.7 精密度與方法回收率 取空白血漿200 μl，配制3個濃度(分別為 0.5、10 和 100 μg/ml)的血漿樣品，按“2.2”項下方法處理后進樣，每個濃度3份，重復3 d測定，并與標準曲線同時進行，計算測得濃度，與理論濃度對照，采用單因素方差分析法求得本法的精密度，用RSD表示。方法回收率用測定濃度的平均值與理論濃度比值的百分數(shù)表示，結(jié)果日內(nèi)RSD＜1.21%，日間RSD＜1.48%，方法回收率平均為99.39%(n=3)，滿足生物樣品分析方法的要求。

2.8 穩(wěn)定性試驗 取空白血漿200 μl，配制3個濃度(分別為 0.5、10、100 μg/ml)的血漿樣品，每個濃度2份，分別考查其在室溫、凍融循環(huán)、－20℃保存以及處理后在室溫條件下的穩(wěn)定性，以當日隨行標準曲線計算血漿樣品中奧沙普秦的濃度，將測定濃度的平均值與理論濃度對照，結(jié)果RE＜±2.5%，表明血漿樣品在室溫放置24 h、凍融3次、－20℃保存3周以及處理后在室溫放置24 h的條件下都是穩(wěn)定的。

2.9 樣品測定 臨床15名男性受試者，受試當日清晨8時空腹口服奧沙普秦腸溶片400 mg，用250 ml溫開水送服。于服藥前及服藥3 h后分別從肘靜脈取血2 ml，置肝素管中放置1 h，3 000 r/min離心10 min分離血漿，置－20℃下凍存?zhèn)溆?。用本法測定受試者服藥后血漿中奧沙普秦的濃度，15名受試者口服奧沙普秦腸溶片400 mg后的平均血藥濃度見表1。結(jié)果表明，所服藥物吸收后3 h內(nèi)血藥濃度即達峰值。

表1 15名受試者單劑量口服奧沙普秦腸溶片(400 mg)3 h后的平均血藥濃度

3 討論

本文采用固相萃取凈化和富集血漿樣品，HPLC法紫外檢測器測定人血漿中奧沙普秦，每一樣品的測定可在15.0 min內(nèi)完成，且此法具有良好的精密度和準確度，為奧沙普秦的血藥濃度及藥代動力學研究提供了可靠的方法。

3.1 樣品的預處理 文獻采用液－液萃取法提取血樣中奧沙普秦［1，2］，操作煩瑣;而用甲醇沉淀蛋白［3］，對樣品稀釋度較大，達不到本研究分析檢測限的要求。本研究采用固相萃取凈化和富集血漿樣品，操作簡便、快速，與文獻相比大大縮短了樣品處理時間，且采用固相萃取凈化和富集血漿樣品，可使樣品濃度高、干擾較少。

3.2 流動相的選擇 曾采用0.02 mol/L乙酸銨溶液作為流動相，奧沙普秦的色譜峰拖尾嚴重，水相改用0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調(diào)至pH 4.5)－甲醇(85∶15)，可使峰形明顯改善;且所用試劑價廉低毒，簡單易得。通過考查流動相組分對測定結(jié)果的影響，確定流動相為0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調(diào)至pH 4.5)－甲醇(85∶15)，在此條件下奧沙普秦峰形對稱、保留時間適中。

1 許長江，江志強，楊香嬡，等.奧沙普秦腸溶膠囊與片在中國健康者的藥物動力學及其相對生物利用度.中國新藥與臨床雜志，2000，19(2):90

2 陳鷹，盛利，李海萍，等.奧沙普秦分散的人體相對生物利用度.中國臨床藥學雜志，2001，10(2):96

3 夏春華，徐文煒，熊玉卿，等.奧沙普秦腸溶片HPLC測定法及其人體生物等效性研究.中國藥理學通報，2006，2(3):366

HPLC with solid phase extraction assay for determ ination of oxaprozin in human plasma

Yan Xiaoqing1，Dong Weilin2
(1.The Tianjin Hospital of Tianjin，Tianjin 300070)

Objective:To establish an HPLC me thod by solid－phase extraction in order to determine of Oxaprozin in human plasma and for human drug plasma concentration determine.Methods:Proteins in plasma samples were precipitated by solid －phase extraction.Kromasil C18was used with the mobile phase of 0.02 mol/L NaH2PO4solution(pH 5.0) － methanol(85∶15)at a flow rate of 1.0 ml/min.The detection wavelength was at 285nm.The endogenous substance in plasma did not interfere with the determination of the samples.Results:The linear range was 0.1 ～100 μg/ml(r=0.999 2)，and the limit of quantitation was 0.1 μg/ml.The method recovery was 99.39%.Both within － day RSD and between － day RSD were less than 2%.Conclusion:The method is simple and accurate.It is suitable for the drug plasma concentration of oxaprozin.

oxaprozin，HPLC，drug plasma concentration

R27.2

A

1006-5687(2012)04-0017-03

2012-05-09