周桂榮，鄂秀輝，李晴川

(天津天士力集團研究院，天津 300402)

反離子對色譜法測定腎炎1號片中鹽酸益母草堿的含量*

周桂榮，鄂秀輝，李晴川

(天津天士力集團研究院，天津 300402)

目的:建立反相離子對色譜法測定腎炎1號片中鹽酸益母草堿含量的方法。方法:Agilent SB－C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相:乙腈 －0.4%辛烷磺酸鈉的0.1%磷酸溶液(24∶76);檢測波長:277 nm;流速:1.0 ml/min。結果:鹽酸益母草堿進樣量在33.6～672.0 ng范圍內(nèi)呈良好的線性關系(r=1，n=6)，平均回收率為99.55%(n=9)，RSD為1.78%。結論:此方法簡便、靈敏度高，重現(xiàn)性好，可用于腎炎1號片中鹽酸益母草堿的檢測。

反相離子對色譜，腎炎1號片，鹽酸益母草堿

腎炎1號片是由益母草、黃芪、白茅根等制成的中藥復方制劑。益母草作為方中臣藥，其化學成分主要有生物堿類、二萜類、甾醇、黃酮類、有機酸等［1］，其中生物堿以水蘇堿(stachydrine)和益母草堿(leonurine)為主。藥理作用研究證明，益母草中的主要有效成分益母草堿能夠抑制血小板的聚集，防止血栓的形成［2］;可擴張外周血管，降低血管阻力，具有一定的抗高血壓、降低冠脈阻力、增加冠脈血流量、保護心臟等藥理作用［3，4］。雖然《中國藥典》2010 年一部對益母草藥材的質量控制增加了鹽酸益母草堿的含量測定標準［5］，但在《中國藥典》及各級藥品標準中，對含益母草制劑的質量控制多是以鹽酸水蘇堿為指標，對于鹽酸益母草堿的含測方法卻罕有研究，這樣不能保證益母草復方制劑的安全、有效。本實驗采用反相離子對色譜法對腎炎1號片中鹽酸益母草堿的含量進行測定，結果發(fā)現(xiàn)此法操作簡便、快速、準確可靠，可用于腎炎1號片中鹽酸益母草堿的檢測。

1 儀器與試藥

儀器:Agilent 1200高效液相色譜儀。試藥:乙腈為色譜純(MERCK)，水為二純水;鹽酸益母草堿對照品(批號111823－201001，上海鼎瑞化工有限公司，純度≥98%);腎炎1號片(批號20111201、20111202、20111203、20111101、20111102、20111103)為本公司制備的中試樣品。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱:Agilent SB－C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流速:1.0 ml/min;柱溫:30℃;流動相:乙腈－0.4%辛烷磺酸鈉的0.1%磷酸溶液(24∶76);檢測波長為277 nm。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取鹽酸益母草堿對照品適量，精密稱定，加70%乙醇制成每1 ml中含30 μg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品適量，研細，取約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 ml，稱重，超聲處理 30 min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 取缺益母草的陰性樣品，按供試品溶液制備方法操作，制備陰性對照溶液。

2.3 方法專屬性試驗 分別取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，依法進樣測定，記錄色譜圖，見圖1。結果，在對照品相同保留時間處無吸收峰。表明樣品中無干擾鹽酸益母草堿的成分存在。

2.4 線性關系考查 分別精密吸取鹽酸益母草堿對照品溶液(33.6 μg/ml)1、2、5、10、15 和 20 μl注入液相色譜儀，測定，由峰面積(Y)和對照品進樣量(X)繪制標準曲線，得回歸方程 Y=1.82 X+0.299 6，(r=1)。結果表明鹽酸益母草堿進樣量在33.6～672.0 ng時，與其峰面積呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10 μl，重復進樣6次，測定，記錄峰面積，計算RSD值為0.63%，說明該儀器的精密度良好。

圖1 對照品(A)供試品(B)陰性對照(C)HPLC色譜圖

2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，室溫放置，分別在0、4、8、12、24、36 和 48 h 各進樣 10 μl，記錄峰面積，計算RSD值為0.79%，結果表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗 精密稱取同一批號(20111201)的腎炎1號片樣品6份，依法測定鹽酸益母草堿含量，計算其RSD值2.46%。結果表明，本法重復性好。

2.8 加樣回收試驗 精密稱取已知含量的同一批腎炎1號片樣品1.0 g，共9份，取重復性項下所測含量作為加入對照品鹽酸益母草堿的依據(jù)，分別精密加入供試品含量的80%、100%和120%各3份，按供試品溶液制備方法制備，測定，計算回收率，鹽酸益母草堿的平均回收率為99.55%，RSD為1.78%。結果見表1。

表1 鹽酸益母草堿回收率試驗結果(n=9)

2.9 樣品含量測定 取6批腎炎1號片中試樣品，按本法測定鹽酸益母草堿的含量，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果(n=3)

3 討論

3.1 色譜條件的選擇系參照《中國藥典》2010版一部中益母草藥材的含量測定方法:采用十八烷基鍵合硅膠為填充劑的色譜柱;流動相:乙腈－0.4%辛烷磺酸鈉的0.1%磷酸溶液(24∶76);檢測波長為277 nm，在此條件下，色譜峰可以得到較好的分離。

3.2 在供試品溶液制備方法的建立中，我們以鹽酸益母草堿的提取率為指標，分別考查了提取方法(超聲提取、加熱回流提取)，提取溶劑(甲醇、不同比例的乙醇－水)，提取溶劑倍數(shù)，提取時間。結果采用70%的乙醇25 ml超聲處理30 min可以將鹽酸益母草堿提取完全，故選擇該法作為供試品溶液制備方法。

3.3 本研究建立的鹽酸益母草堿的檢驗方法，操作簡便、靈敏度高、重現(xiàn)性好，為腎炎1號片質量標準的制定提供依據(jù)。

1 張嫻，彭國平.益母草屬化學成分研究進展.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2003，15(2):162

2 周遠鵬，劉文化，邵國賢.益母草堿、丁香酰胍醇及丁香酸氨基醇酯類化合物抗血小板聚集活性及其與結構的關系.中國藥學雜志，1996，31(5):271

3 鄭虎占，董澤宏，余靖.中藥現(xiàn)代研究與應用.北京:學苑出版社，1998:3803

4 丁伯平，熊鶯，徐朝陽，等.益母草堿對急性血瘀證大鼠血液流變學的影響.中國中醫(yī)藥科技，2004，11(1):36

5 中國藥典.二部.2010:272

R927.2

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2012-05-18