黃秀蓉 鄧小紅 李楠 陳莉平 劉小紅 余蓉

近30年來,隨著眼科光學(xué)診療器械應(yīng)用的日益增多,人們對各種眼科光學(xué)診療器械光源導(dǎo)致的視網(wǎng)膜損傷等問題進(jìn)行了較深入的研究。現(xiàn)代研究表明[2],眼科常用的診療器械如裂隙燈、間接檢眼鏡、手術(shù)顯微鏡等均可造成視網(wǎng)膜光損傷。研究表明視網(wǎng)膜光損傷的病理過程主要表現(xiàn)為視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞的凋亡[3],是一種退行性病變過程。 有學(xué)者報道,葛根素可減輕氧化損傷,抑制細(xì)胞凋亡[4]。本實驗采用顯微鏡所致大鼠急性視網(wǎng)膜光損傷模型作為對象,通過視網(wǎng)膜病理形態(tài)學(xué)觀察、組織生化學(xué)檢查等手段,從形態(tài)學(xué)、生化學(xué)等方面研究葛根素注射液對視網(wǎng)膜急性光損傷修復(fù)的影響,并探討其對視網(wǎng)膜的保護作用。

1 實驗方法

1.1分組方法 48只SD大鼠購回馴養(yǎng)1周后,隨機選取12只大鼠24眼為正常對照組(簡稱正常組),另36只大鼠72眼進(jìn)行急性光損傷造模,造模成功后隨機分為模型對照組(簡稱模型組)、高劑量治療組(簡稱高劑量組)、低劑量治療組(低劑量組),每組12只動物,24只眼。

1.2造模方法 光照前充分暗適應(yīng)24小時,大鼠按30mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射全麻,雙眼愛爾凱因表麻,阿托品眼液充分散瞳,置于手術(shù)顯微平臺上,分別照射左右眼。光照強度為22000±1000lux(用ST-III型光度計測定),距角膜距離為150±3mm,垂直照射大鼠瞳孔,照射時間為30 分鐘,光照過程中角膜完全暴露,間斷角膜滴水濕潤眼球表面;室溫控制在21～24℃左右;全部照射完后再次暗適應(yīng)24小時。

1.3給藥方法 高劑量組:葛根素成人日用量20倍,兌生理鹽水尾靜脈注射(168mg/kg);低劑量組:葛根素成人日用量5倍,兌生理鹽水尾靜脈注射(42mg/kg);正常組:等容量生理鹽水,尾靜脈注射;模型對照組:給等容量生理鹽水,尾靜脈注射。每日1次,連續(xù)給藥1周。

1.4觀察指標(biāo)及測試方法：給藥1周后處死動物,速取右眼,進(jìn)行視網(wǎng)膜光鏡及免疫組化檢查。

1.4.1HE染色 動物處死后摘除眼球,并在手術(shù)顯微鏡下去除角膜、晶體及玻璃體后,立即放入10%中性福爾馬林溶液中固定48小時,經(jīng)逐級酒精脫水,二甲苯透明、浸臘,石蠟包埋。經(jīng)視乳頭矢狀面縱向做4～5μm厚的切片,HE染色;在Mias-2000圖形分析系統(tǒng)下觀察,記錄200倍鏡下視網(wǎng)膜外核層連續(xù)5個視野的面積和外核層細(xì)胞核的含量。

1.4.2Cyt-c、Caspase-3表達(dá) 首先將SP法染色切片在10×10低倍視野下進(jìn)行全面觀察,尋找視網(wǎng)膜內(nèi)Cyt-c、Caspase-3陽性物質(zhì)最豐富區(qū)域然后在10×20中倍視野下選擇5個熱點區(qū),采用MIAS-2000型圖像分析系統(tǒng)測量各個指標(biāo)陽性物質(zhì)的面積、平均光密度、積分光密度和平均黑度,表示它們的含量。鏡下觀察Cyt-c、Caspase-3陽性物質(zhì)棕褐色至淡黃色,呈細(xì)絲狀或者細(xì)顆粒狀,主要表達(dá)部位在視網(wǎng)膜細(xì)胞胞漿內(nèi)。

2 結(jié)果

2.1對大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)影響

(1)正常組 視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)層次分明,光感受器細(xì)胞視桿內(nèi)、外節(jié)排列整齊規(guī)則,分界清晰,內(nèi)、外核層排列緊密,染色均勻,細(xì)胞形態(tài)規(guī)整。

(2)模型組 視網(wǎng)膜外核層變薄,細(xì)胞排列較正常組稀疏,出現(xiàn)較多染色不規(guī)則或破碎的細(xì)胞核。內(nèi)外節(jié)排列紊亂,分界欠清,出現(xiàn)不規(guī)則淡染區(qū)。

(3)治療組 高劑量組:同模型組相比,無明顯改變,外核層變薄,細(xì)胞排列稀疏,內(nèi)外節(jié)排列紊亂,分界不清。低劑量組:視網(wǎng)膜外核層較模型組增厚,細(xì)胞排列致密。

各組間視網(wǎng)膜外核層HE染色結(jié)果比較

△與正常組比較:P<0.05;*與模型組比較:P<0.05

上表提示:模型組、高劑量組的積分光密度、面積與正常組比較,均明顯低于正常組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);低劑量組與模型組比較,面積、積分光密度增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2葛根素注射液對大鼠視網(wǎng)膜Cyt-c表達(dá)的影響

正常組視網(wǎng)膜外核層細(xì)胞漿中Cyt-c陽性物質(zhì)含量較少。模型組視網(wǎng)膜外核層細(xì)胞漿中Cyt-c陽性物質(zhì)含量較多。用藥各組視網(wǎng)膜外核層細(xì)胞漿中Cyt-c陽性物質(zhì)有不同程度減少,檢測結(jié)果見下表:

葛根素注射液對大鼠視網(wǎng)膜Cyt-c表達(dá)的影響比較

與正常組比較:△P<0.05;△△P<0.01與模型對照組比較:*P<0.05;**P<0.01

上表提示:模型對照組與治療組的Cyt-c面積、積分光密度、平均黑度及平均光密度均高于正常組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);高劑量組與模型對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);低劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示低劑量組葛根素注射液具有使光損傷后大鼠視網(wǎng)膜Cyt-c含量降低的作用。

2.3葛根素注射液對大鼠視網(wǎng)膜Caspase-3表達(dá)的影響

正常組視網(wǎng)膜外核層細(xì)胞漿中Caspase-3陽性物質(zhì)含量較少。模型組視網(wǎng)膜外核層細(xì)胞漿中Caspase-3陽性物質(zhì)含量較多。用藥各組視網(wǎng)膜外核層細(xì)胞漿中Caspase-3陽性物質(zhì)有不同程度減少,檢測結(jié)果見下表:

葛根素注射液對大鼠視網(wǎng)膜Caspase-3表達(dá)的影響的比較

與正常組比較:△P<0.05;△△P<0.01與模型組比較:*P<0.05;**P<0.01

上表提示:模型組與治療組的Caspase-3蛋白酶表達(dá)的面積、積分光密度、平均黑度及平均光密度均明顯高于正常組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);高劑量與模型組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);低劑量與模型組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示:低劑量組葛根素注射液 具有使光損傷后大鼠視網(wǎng)膜Caspase-3的表達(dá)降低的作用。

3 討論

葛根素成品制劑主要有葛根素注射液,葛根黃酮片等。近年來國內(nèi)學(xué)者對葛根素的藥理作用和臨床應(yīng)用做了大量的研究:葛根素具有降壓、擴張冠狀動脈和腦血管抗血小板凝聚等作用,主要用于治療冠心病、高血壓病、糖尿病[5,6]等。同時,葛根素治療眼科疾病的驗案也屢有報道,主要用于治療視網(wǎng)膜動脈阻塞、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、糖尿病視網(wǎng)膜病變以及青光眼[7]等。視網(wǎng)膜光損傷及視網(wǎng)膜變性疾病如視網(wǎng)膜色素變性都是一種退行性病變過程,表現(xiàn)為視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的凋亡。有研究表明:葛根素對氧自由基有清除作用,可減輕氧化損傷,抑制細(xì)胞凋亡,并能預(yù)防性對抗過氧化氫引起的氧化性損傷[4,8]。

本實驗結(jié)果顯示①葛根素注射液可降低急性視網(wǎng)膜光損傷視細(xì)胞Cyt-c的表達(dá)水平,提示葛根素注射液對視細(xì)胞損傷的保護作用很可能通過抑制細(xì)胞表達(dá)Cyt-c而實現(xiàn)的,但具體機制還有待以后進(jìn)一步研究。② 葛根素注射液低劑量組Caspase-3呈較明顯下降趨勢,與模型組比較有顯著性差異,提示葛根素注射液可能通過降低凋亡因子Caspase-3的表達(dá),最終達(dá)到有效拮抗光刺激誘發(fā)的光感受器細(xì)胞的凋亡。

綜上所述,葛根素注射液可減輕視網(wǎng)膜光損傷。其機制主要為:通過調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡相關(guān)基因減少視網(wǎng)膜中Cyt-c、Caspase-3的表達(dá),從而抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡,起到了保護視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞的作用。

[1] Cruicks hanks KJ,Klein R,Kleim BE,etal.Sunlight and age related macular degeneration .Arch Ophthalmol,1993,111:514-518.

[2] Mchil M.Sterbeger P.Bustom,etal.operating microscope induced retinal:photosixity pathophysilogy clinical manifestation and prevention Sury Ophthalmol,1990,34,237-252.

[3] Shahinfar S,Edward D P,TsoMOM.Apathologic study of photoreceptor cell death in retinal photic injury.Curr Eye Res,1991,10(1):47-59.

[4] 吳艷,萬華印.葛根素抗培養(yǎng)腦細(xì)胞阿霉素?fù)p傷作用[J].中國病理生理雜志,2003,19(10):1413-1415.

[5] 蔣定伍.葛根素治療不穩(wěn)定型心絞痛的臨床觀察[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥,2010,29(12).

[6] 廖凌云,陳云.葛根素注射液結(jié)合硫酸鎂治療妊娠高血壓綜合征80例臨床觀察[J].贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2010,30(1).

[7] 馬蘭.葛根素注射液治療視網(wǎng)膜中央動脈阻塞10例分析[J].中外健康文摘,2010,12(7).

[8] 朱慶磊,何愛霞等.葛根素對氧自由基的清除何抗氧化性損傷作用[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報,2001,17(1):1-3.