曾青蘭，孫連連，王志勇

（咸寧職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程系，湖北 咸寧 437100）

L－纈氨酸是人體必需氨基酸之一，具有多種生理功能.在醫(yī)藥上，L－纈氨酸主要用于配制復(fù)合氨基酸制劑，特別是應(yīng)用于配制高支鏈氨基酸輸液及口服液.國內(nèi)外大批量生產(chǎn)L－纈氨酸均采用微生物發(fā)酵法［1］.作者采用谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）CICC20887，在搖瓶條件下研究發(fā)酵工藝條件對(duì)L－纈氨酸產(chǎn)量的影響，以期為該菌工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)L－纈氨酸奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 菌種

谷氨酸棒桿菌CICC20887，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心.

1.2 培養(yǎng)基配方

1.2.1 斜面培養(yǎng)基配方 葡萄糖：5.0g／L，NaCl：5.0g／L，牛肉膏：10.0g／L，蛋白胨：10.0g／L，酵母膏：5.0g／L，瓊脂條：20.0g／L.用30% 的NaOH調(diào)pH＝7，0.1MPa滅菌20min［2］.

1.2.2 種子培養(yǎng)基配方 葡萄糖：25.0g／L，硫酸銨：5.0g／L，玉 米 漿：40.0g／L，豆餅水解液：2.5g／L，磷酸二氫鉀：1.0g／L，硫酸鎂：0.5g／L，硫酸亞鐵：0.01g／L，硫酸錳：0.01g／L，輕質(zhì)碳酸鈣：10.0g／L，L－Met：0.3g／L，L－Ileu：0.2g／L，生物素（VH）：100 μg／L，硫胺素（VB1HCl）：200μg／L.用30%的 NaOH 的調(diào)pH＝7，滅菌條件0.1MPa滅菌20min［3］.

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基配方葡萄糖：70.0～120.0g／L，硫酸銨：40.0g／L，玉米漿：25.0g／L，磷酸二氫鉀：1.0g／L，硫酸鎂：0.5g／L，硫酸亞鐵：0.01g／L，硫酸錳：0.01g／L，輕質(zhì)碳酸鈣：10.0g／L，生物素（VH）：20～100μg／L，硫胺素（VB1HCl）：200μg／L.用30%的 NaOH 調(diào)pH＝7，0.07MPa滅菌20min［2］.

1.3 發(fā)酵工藝條件的設(shè)定

采用單因素實(shí)驗(yàn)，設(shè)定不同發(fā)酵工藝條件進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，分析不同的發(fā)酵工藝條件對(duì)谷氨酸棒桿菌CICC20887產(chǎn)纈氨酸的影響.

1.4 L－纈氨酸測(cè)定方法

采用紙上層析法.

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 精密稱取纈氨酸標(biāo)準(zhǔn)品0.06g、0.14g、0.22g、0.30g、0.38g、0.46g，分別置于10ml容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻.分別吸取1μL于層析濾紙上，在層析液［V（正丁醇）∶V（冰乙酸）∶V（H2O）＝4∶1∶1］中展開，60℃烘干，用0.05%茚三酮－丙酮溶液噴濕，60℃烘干，顯色［3］.剪下斑點(diǎn)放入10mL的 CuSO4－75%C2H5OH溶液洗脫，常溫靜置2h，直至斑點(diǎn)完全洗脫［4，6］.以洗脫劑作空白對(duì)照，在S22PC型分光光度計(jì)520nm處測(cè)定洗脫液的吸光度，以纈氨酸標(biāo)含量作橫坐標(biāo)，以洗脫液的吸光度作縱坐標(biāo)，用Excel軟件處理，得纈氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程.

1.4.2 發(fā)酵液中L－纈氨酸含量的測(cè)定 取發(fā)酵液高速離心（8 000r／min）2min，上清液置于4℃冷藏待測(cè).根據(jù)發(fā)酵液中L－纈氨酸濃度確定樣品稀釋倍數(shù).

取纈氨酸稀釋發(fā)酵液1μL點(diǎn)樣于層析濾紙上，照上法操作，測(cè)得吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上換算出纈氨酸含量.

1.5 pH值測(cè)定方法

精密pH 試紙，pH：6.0～8.0或pH 計(jì).

2 結(jié)果與討論

2.1 初糖濃度對(duì)L－纈氨酸產(chǎn)量的影響

谷氨酸棒桿菌CICC20887在30℃，搖床轉(zhuǎn)速為120r／min時(shí)，搖瓶發(fā)酵72h時(shí)，不同初糖濃度對(duì)L－纈氨酸產(chǎn)量的影響如圖1.結(jié)果表明，發(fā)酵培養(yǎng)基中初糖濃度為90g／L時(shí)，發(fā)酵72h，L－纈氨酸的相對(duì)含量最高，過高或過低L－纈氨酸的相對(duì)含量明顯下降.因?yàn)樵诎l(fā)酵過程中，葡萄糖既為菌體生長提供所需的碳源，也為菌體合成L－纈氨酸提供所需碳的骨架，葡萄糖過低，限制了菌體的生長和L－纈氨酸的合成，但若過高，則會(huì)增加菌體外環(huán)境的滲透壓，使發(fā)酵速度變慢，產(chǎn)酸率也會(huì)下降.

圖1 初糖濃度對(duì)L－纈氨酸產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of concentration of initial glucose on the yield of L－valine

2.2 生物素對(duì)L－纈氨酸產(chǎn)量的影響

圖2 生物素對(duì)L－纈氨酸產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of D－biotin on the yield of L－valine

谷氨酸棒桿菌為生物素（VH）需求型.生物素作為酶的輔助因子以多種方式參與細(xì)菌的代謝過程，因此，生物素的用量直接影響生產(chǎn)菌的細(xì)胞生長、增殖、代謝及細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的通透性和產(chǎn)酸量的高低.在L－纈氨酸的生產(chǎn)中，生物素不足，代謝途徑會(huì)向三羧酸循環(huán)方向發(fā)展，不利于L－纈氨酸的生成，因此，生物素要求相對(duì)過剩些.圖2反映了生物素的不同添加量對(duì)L－纈氨酸產(chǎn)量的影響.結(jié)果表明，發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素添加量為80μg／L時(shí)，搖瓶發(fā)酵72h，L－纈氨酸的相對(duì)含量最高.

2.3 VB1的不同添加量對(duì)L－纈氨酸產(chǎn)量的影響

圖3反映了不同的VB1添加量對(duì)L－纈氨酸產(chǎn)量的影響.發(fā)酵培養(yǎng)基中VB1添加量為0.20mg／L時(shí)，搖瓶發(fā)酵72h，L－纈氨酸的相對(duì)含量最高，隨著VB1添加量的增大，L－纈氨酸的相對(duì)含量明顯下降，這可能是由于過量的VB1在菌體內(nèi)轉(zhuǎn)化成硫銨素焦磷酸（TPP），后者作為丙酮酸脫氫酶復(fù)合體系的輔助因子，促進(jìn)了丙酮酸脫氫生成乙酰CoA進(jìn)入TCA循環(huán)，從而減少了L－纈氨酸的合成.

2.4 玉米漿對(duì)L－纈氨酸產(chǎn)量的影響

玉米漿成分較為復(fù)雜，含氨基酸、生物素等多種營養(yǎng)因子，為谷氨酸棒桿菌生長與代謝提供了必要的營養(yǎng)成分，對(duì)菌體的生長有明顯的促進(jìn)作用.圖4反映了不同的玉米漿添加量對(duì)L－纈氨酸產(chǎn)量的影響.結(jié)果表明，發(fā)酵培養(yǎng)基中玉米漿添加量為30g／L時(shí)，搖瓶發(fā)酵72h，L－纈氨酸的相對(duì)含量最高.

圖3 VB1對(duì)L－纈氨酸產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of VB1on the yield of L－valine

圖4 玉米漿對(duì)L－纈氨酸產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of corn syrup on the yield of L－valine

2.5 pH對(duì)L－纈氨酸產(chǎn)量的影響

本實(shí)驗(yàn)采用了2種pH值的形式：自然pH和前期（前24h）pH 值控制在6.5～6.7、中后期（后48h）控制在7.0～7.2.結(jié)果（圖5）表明，后一種形式所獲L－纈氨酸產(chǎn)量比未調(diào)pH的高出1倍多.

2.6 培養(yǎng)溫度對(duì)L－纈氨酸產(chǎn)量的影響

溫度是影響生物菌種的生長和產(chǎn)酸的一個(gè)基本物理因素.實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖6）表明，該菌發(fā)酵產(chǎn)L－纈氨酸的適宜溫度為30～31℃.

圖5 pH對(duì)L－纈氨酸產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of pH on the yield of L－valine

圖6 溫度對(duì)L－纈氨酸產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of temperature on the yield of L－valine

2.7 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)L－纈氨酸產(chǎn)量的影響

在上實(shí)驗(yàn)確定的適宜的發(fā)酵條件下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，在發(fā)酵過程中每隔6h取樣檢測(cè)，結(jié)果如圖7所示.從圖中可以看出，谷氨酸棒桿菌CICC20887在24h即可檢測(cè)到L－纈氨酸的存在，其產(chǎn)L－纈氨酸的高峰在66～72h，此為該菌的最佳發(fā)酵周期，此后發(fā)酵液中的L－纈氨酸量開始減弱.

3 結(jié)論

圖7 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)L－纈氨酸產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of incubating time on the yield of L－valine

谷氨酸棒桿菌CICC20887的發(fā)酵工藝條件研究表明，發(fā)酵生產(chǎn)L－纈氨酸的適宜初糖濃度為90g／L，添加生物素、玉米漿、VB1有利于L－纈氨酸的生產(chǎn)，其適宜添加量分別為80μg／L、30g／L、0.20mg／L，發(fā)酵期間，前24hpH 值應(yīng)控制在6.5～6.7、后48h應(yīng)控制在7.0～7.2，發(fā)酵適宜溫度為30～31℃，發(fā)酵周期應(yīng)控制在66～72h.次研究結(jié)果可為該菌工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)L－纈氨酸提供基礎(chǔ).

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