乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤，肥胖癥亦被認(rèn)為是乳腺癌的一個危險因素。Caspase-3是最重要的效應(yīng)性蛋白裂解酶，在乳腺癌、神經(jīng)纖維瘤等腫瘤細(xì)胞中均有Caspase-3過表達(dá)。激活的Caspase-3能裂解一定量的底物，包括抗凋亡成分及結(jié)構(gòu)或看家蛋白，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡?；谏鲜鲅芯窟M(jìn)展，本研究采用免疫組化和TUNEL方法，檢測肥胖和正常體重患者乳腺癌組織中Caspase-3蛋白表達(dá)和細(xì)胞凋亡，研究其與肥胖乳腺癌的臨床特征及預(yù)后的相關(guān)性。

資料與方法

一般資料：所有研究對象均為女性，選擇60例肥胖乳腺癌患者，60例正常體重乳腺癌患者，術(shù)前均未化療，根據(jù)國際抗癌協(xié)會建議以T(原發(fā)癌)、N(局部淋巴結(jié))、M(遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移)對乳腺癌進(jìn)行分期，所有病例術(shù)前未行任何治療，術(shù)后均經(jīng)病理檢查證實診斷，全部病例均經(jīng)細(xì)胞學(xué)或組織病理學(xué)證實。肥胖癥的診斷符合WHO為亞洲成年人制定的標(biāo)準(zhǔn)，即體重指數(shù)≥25kg/m2。各組每例乳腺癌組織標(biāo)本取材后4%多聚甲醛固定。

身高、體重測量：固定專人，測量身高(m)和體重(kg)。測得身高和體重數(shù)據(jù)精確至01cm和01kg，體重指數(shù)(BMI)=體重(kg)/身高(m2)。

試劑與儀器：兔抗Caspase-8和Caspase-3單克隆抗體、生物素標(biāo)記二抗和TUNEL凋亡試劑盒均購于北京中杉生物公司。

TUNEL檢測細(xì)胞凋亡：采用細(xì)胞凋亡試劑盒(北京中杉生物工程有限公司的產(chǎn)品)，按照試劑盒說明書操作，免疫組化ABC染色法，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染、脫水、透明、封片。細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為原位末端標(biāo)記陽性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。采用顯微鏡計數(shù)法(10目鏡×40物鏡)，觀察每個高倍視野的凋亡細(xì)胞數(shù)，每只動物隨機(jī)取3張切片，每張切片隨機(jī)觀察6個視野。細(xì)胞凋亡指數(shù)的測定(apoptotic index AⅠ)：每張切片選擇5個陽性染色最明顯高倍視野(×400)計數(shù)500個腫瘤細(xì)胞中陽性細(xì)胞所占的百分比。

免疫組化結(jié)果的判斷：陽性結(jié)果呈棕黃色或棕褐色，Caspase-3陽性細(xì)胞分別為細(xì)胞質(zhì)顯色，Caspase-3蛋白表達(dá)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)如下。用計算機(jī)圖像分析技術(shù)半定量監(jiān)測其蛋白表達(dá)的強(qiáng)弱，應(yīng)用Image-Pro Plus 50彩色病理圖文分析系統(tǒng)隨機(jī)選取5個視野，測定乳腺癌組織Caspase-3免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物平均光密度值，以平均光密度值來進(jìn)行量化后的統(tǒng)計學(xué)分析。

統(tǒng)計學(xué)處理：使用SPSS130軟件包。所得數(shù)據(jù)以X±S表示，采用方差分析；P＜005為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

兩組患者一般情況比較：肥胖組患者平均年齡5135±775歲，正常體重組為4964±617歲，兩組相比差異無顯著性(P＞005)。肥胖組(2851±555)和正常體重組(1945±479)體重比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜005)。

TUNEL法檢測各組乳腺癌細(xì)胞凋亡：光學(xué)顯微鏡下觀察，細(xì)胞核濃縮，染色質(zhì)凝集，呈圓形或新月形，體積變小，核被標(biāo)記成棕黃色的細(xì)胞即為凋亡細(xì)胞。正常體重組中腫瘤細(xì)胞有凋亡現(xiàn)象，凋亡率為038±007。肥胖組凋亡率為013±002，較正常體重組降低，表明肥胖組細(xì)胞凋亡作用明顯低于正常體重組(P＜001)。

各組乳腺組織中Caspase-3蛋白表達(dá)及與細(xì)胞凋亡二者的相關(guān)性：肥胖組乳腺組織Caspase-3蛋白表達(dá)的平均光密度值為017±005，正常體重組為056±014，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜005)。肥胖患者乳腺癌細(xì)胞凋亡與Caspase-3蛋白表達(dá)的相關(guān)系數(shù)(r=086，P＜005)；正常體重組乳腺癌細(xì)胞凋亡與Caspase-3蛋白表達(dá)的相關(guān)系數(shù)(r=038，P＜005)。Caspase-3蛋白表達(dá)與5年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系：60例正常體重乳腺癌Caspase-3陽性患者17例中，有13例(765%)發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移；而43例Caspase-3陰性患者中，37例(814%)發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，經(jīng)比較無統(tǒng)計學(xué)差異。60例肥胖乳腺癌39陽性患者中，15例(385%)發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移；而21例Caspase-3陰性患者中，有16例(762%)發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，有顯著性差異。見表1。

討論

乳腺癌是婦女最常見的惡性腫瘤之一，在許多國家和地區(qū)居女性惡性腫瘤的首位。引起乳腺癌的發(fā)病因素很多如遺傳因素、內(nèi)分泌因素、物理因素等，其中肥胖為其發(fā)病的高危因素之一，日益受到人們的重視。體重過重和肥胖增加了患乳腺癌的風(fēng)險［1］。

細(xì)胞凋亡是基因控制的細(xì)胞自主性死亡。Caspase為含半胱氨酸的天冬氨酸特異水解酶，是凋亡的主要執(zhí)行者，Caspase分啟動型、效應(yīng)型和炎癥型3型［2］。Caspase-3是哺乳類動物細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，在Caspase家族中屬于效應(yīng)型，在引起細(xì)胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)中處于核心；在正常情況下，胞質(zhì)中的Caspase-3以無活性的酶原形式存在只有當(dāng)細(xì)胞凋亡時，才被激活為有活性的Caspase-3［3～4］。近年來發(fā)現(xiàn)Caspase-3參與了腫瘤發(fā)生過程中細(xì)胞凋亡異常的病理過程［5］。

本組研究表明，肥胖乳腺癌組織中，Caspase-3的陽性表達(dá)率低于對照組正常體重乳腺癌組織(P＜005)，肥胖患者乳腺癌組織中，Caspase-3的陽性表達(dá)低于正常體重患者乳腺癌組織(P＜005)，肥胖乳腺癌組織中Caspase-3蛋白表達(dá)與細(xì)胞凋亡無明顯相關(guān)，且本研究結(jié)果提示，與正常體重乳腺癌患者比較，肥胖乳腺癌患者乳腺癌組織Caspase-3蛋白陽性的表達(dá)肥胖乳腺癌患者5年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中起重要作用。因此推測Caspase-3參與了乳腺癌組織的發(fā)育及轉(zhuǎn)化細(xì)胞凋亡過程的調(diào)節(jié)，Caspase-3表達(dá)促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的生長，在肥胖相關(guān)性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中可能起重要的作用［6］。

綜上所述，肥胖乳腺癌患者組織中的Caspase-3表達(dá)減少是促進(jìn)乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的高危因素，并且使乳腺癌的惡化和影響預(yù)后。預(yù)防肥胖對降低患乳腺癌的發(fā)病率有積極的意義。

參考文獻(xiàn)

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3Blagonravov ML，Onufriev MV，Demurov EA，et al.Assessment of Caspase-3 activity in rabbit myocardial tissue during experimental hemodynamic overload of the left ventricle of the heart［J］.Biomed Khim，2010，56(6):719-725.

4Kakinohana M，Kida K，Minamishima S，et al.Delayed paraplegia after spinal cord ischemic injury requires Caspase-3 activation in mice［J］.Stroke，2011，42(8):2302-2307.

5Thomas CM，Murray R，Sharif M.Chondrocyte apoptosis determined by Caspase-3 expression varies with fibronectin distribution in equine articular cartilage［J］.Int J Rheum Dis，2011，14(3):290-7.

6Poparlan T，Musca S.Role of prognostic factors in evaluation of survival in breast cancer［J］.Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi，2010，114(1):147-51.